生物技术制药 (2).ppt

二、改形抗体Ig分子中参与构成抗原结合部位的区域是H和L链V区中的互补性决定区（CDR区），而不是整个可变区。H和L链各有三个CDR，其他部分称为框架区。如果用鼠源性单克隆抗体的CDR序列替换人Ig分子中CDR序列，则可使人的Ig分子具有鼠源性单克隆抗体的抗原结合特异性。抗体分子中鼠源性部分只占很小比例，可基本消除免疫原性。这种改形抗体（reshapingantibody）又称CDR移植抗体（CDRgraftingantibody）。书中表4-5给出几种改形抗体及其潜在的临床应用。第31页,共46页，星期六，2024年，5月三、小分子抗体基因工程小分子抗体仅表达鼠源性单克隆抗体的V区片段，其相对分子量仅为原抗体的1/80~1/3。也就是说，保留了CDR区，而Ig分子的C区不表达。现在研制的小分子抗体有以下几种类型：（1）Fab抗体，由完整的轻链和重链（VH和CH1）所组成。（2）FV抗体，由VH和VL组成，天然FV片段中VH和VL为非共价性结合。（3）单链抗体（singlechainantibodySCA或singlechainFV,SCFV），由VH和VL通过一段连接肽（linker）连接而成的重组蛋白。有分子量小、穿透力强、免疫原性小特点，可与效应分子相连接构建新功能抗体分子，是构建免疫毒素和双特异抗体的理想元件。（4）单域抗体，由VH(VL)单个可变区组成的，只有抗体分子的1/12，而且表面疏水性强，与抗原非特异结合能力也强。（5）最小识别单位（MRU）是由单个CDR区构成的小分子抗体，亲和力较低。第32页,共46页，星期六，2024年，5月四、双功能抗体双功能抗体就是双特异性抗体（biospecificantibody,BsAb）。它是一种非天然性的抗体，其结合抗原的两个臂具有不同的特异性。1、化学交联法2、生物学方法（杂种-杂交瘤）杂交瘤细胞与脾细胞融合得到可分泌两种亲代抗体和杂种抗体的杂种-杂交瘤细胞。3、基因工程方法采用适当的接头连接不同抗体的VH和VL区，使它们不能形成链内的分子内配对，让其形成原抗体的分子内配对，构建双特异性（SCFV)2。第33页,共46页，星期六，2024年，5月五、抗体融合蛋白类型有：（1）配基-配基型融合蛋白，如CD4-Fc?。（2）配基-Ig嵌合型蛋白，如IL-2-Ig。（3）配基-FV型嵌合蛋白，如CD4-FVCD3。（40受体-FV型融合蛋白。（5）酶-抗体型融合蛋白。其中较为成熟的是配基-Ig型嵌合蛋白，而酶-抗体型融合蛋白（即抗体酶，abeneyme）在药物治疗中应用前景广阔，它可在靶向位置上将前体药物转化成有效的药物，避免对正常组织的伤害，此法称为抗体介导的酶前体药物治疗。第34页,共46页，星期六，2024年，5月五、抗体融合蛋白构建抗体融合蛋白的原则是：将第一个蛋白的终止密码子删除，再接上带有终止密码子的第二个蛋白基因，即可实现两个基因共表达。在抗体的N端和C端融合其它蛋白都可以获得成功。关键是两个蛋白间的接头序列linker，一般说来3~5个氨基酸就可满足大部分融合蛋白的正确折叠的要求。如加入一段有疏水性和一定伸展性的长链，可缓解两种蛋白的相互干扰。第35页,共46页，星期六，2024年，5月第四节基因工程抗体和抗体工程一、噬菌体抗体库技术的基本方法1、获得目的基因2、抗体库技术的载体：现在普遍使用噬菌粒（phagemid）载体，其中的pHEN1为新一代载体，转化效率高，有利于提高库容量。3、淘筛：抗原固定化后，对噬菌粒群的吸附、洗涤和洗脱后再感染扩增，与辅助噬菌体超感染获得大容量次级文库，再反复与抗原吸附，经几轮淘筛后，淘汰了非目的克隆，且使目的克隆大量扩增。四、表达与鉴定：目的克隆经过鉴定后，再导入感受态菌株，进行可溶性表达，其产物用westernblot分析确定后，就完成了全过程。第36页,共46页，星期六，2024年，5月二、噬菌体抗体库技术的特点1、模拟天然全套抗体库抗体文库?1011库容，能包含B细胞全部克隆。建库的外源基因来自人外周血、骨髓或脾脏的淋巴细胞提取的mRNA反转录形成的cDNA扩增，使用的通用引物采自多个人体，具有人的种属普遍性。VH和VL随机重组增加抗体的多样性。2、避开了人工免疫和杂交瘤技术3、可获得高亲和力的人源化抗体在噬菌体抗体库中，VH和VL基因的随机重组模拟了体内抗体亲和力成熟过程，所用抗体基因又都是来自人体，因此产生的抗体必然都是高亲和力的。第37页,共46页，星期六，2024年，5月三、基因工程抗体的表达1、原核细胞表达2、真核细胞表达3、转基因植物表达4、转基因动物表达第38页,共46页，星期六，2024年，5月