实时荧光定量PCR具体实验步骤.pdfVIP

士不可以不弘毅，任重而道远。仁以为己任，不亦重乎?死而后已，不亦远乎?——《论语》

实时荧光定量PCR操作步骤

以下实验步骤仅供参考：

1样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯

仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到

3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为

下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分

配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂

的60%。

③RNA沉淀将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等

体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分

钟后，于4℃下12000rpm离心10分钟。此时离心前不可见的RNA

沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。

④RNA清洗移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至

少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCHO配制），清洗RNA沉淀。

2

混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中

干燥5-10分钟。

⑥溶解RNA沉淀溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反

复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

士不可以不弘毅，任重而道远。仁以为己任，不亦重乎?死而后已，不亦远乎?——《论语》

2RNA质量检测

1）紫外吸收法测定

先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液

用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处

的吸收值，测定RNA溶液浓度和纯度。

①浓度测定

A260下读值为1表示40μgRNA/ml。样品RNA浓度(μg/ml)计算

公式为：A260×稀释倍数×40μg/ml。具体计算如下：

RNA溶于40μlDEPC水中，取5ul，1:100稀释至495μl的TE

中，测得A260=0.21

RNA浓度=0.21×100×40μg/ml=840μg/ml或0.84μg/μl

取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35μl，剩余RNA总量为：

35μl×0.84μg/μl=29.4μg

②纯度检测

RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。

2）变性琼脂糖凝胶电泳测定

①制胶

1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10ml的10×MOPS电泳

缓冲液和18ml的37%甲醛溶液(12.3M)。

10×MOPS电泳缓冲液

浓度??成分

0.4M??MOPS，pH7.0

士不可以不弘毅，任重而道远。仁以为己任，不亦重乎?死而后已，不亦远乎?——《论语》

0.1M??乙酸钠

0.01M??EDTA

灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25μl溶液。胶凝后取下

梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至

覆盖胶面几个毫米。