特殊毒性及其试验与评价方法 (2).ppt

**********第64页,共87页，星期六，2024年，5月染色体的断片或迟滞的染色体在细胞分裂后期，由于不能进入子细胞的核中而在间期的子细胞胞浆内形成的游离团块物质，它与细胞主核着色一致，圆形或椭圆形。4、微核（micronucleus）试验第65页,共87页，星期六，2024年，5月第66页,共87页，星期六，2024年，5月无核细胞红细胞有核细胞中微核难与正常核分叶及核突出物区别微核试验第67页,共87页，星期六，2024年，5月常用啮齿类动物骨髓嗜多染红细胞(PCE)或外周血细胞进行微核试验。PCE是红细胞成熟的一个阶段，此时红细胞的主核已排出，微核容易辩认，PCE胞质含RNA染色与成熟红细胞易于区别，故为骨髓微核试验的首选细胞群。一般采用多次染毒后24h采样。第68页,共87页，星期六，2024年，5月红细胞的分化成熟过程第69页,共87页，星期六，2024年，5月第70页,共87页，星期六，2024年，5月第71页,共87页，星期六，2024年，5月MNNCEIllustrationofabinuclearhumanlymphocytecontainingamicronucleus(arrow).Nuclearmaterialappearsinyellow,cytoplasminred.Acridin-Orangestaining,fluorescencemicroscopy,enlargement1000fold第72页,共87页，星期六，2024年，5月试验步骤健康成年ICR小鼠，实验前24h予环磷酰胺40mg/kg腹腔注射染毒。小鼠颈椎脱臼处死，取双侧后肢股骨，纱布擦去多余肌肉和血污，剪去两端骨垢，用注射器吸取小牛血清，插入骨髓腔内，将骨髓冲入离心管，然后用吸管吹打骨髓团块混匀。以1000r/min速度离心10min，弃上清液，留下约0.5ml沉淀物混匀后，滴片两张，推片。将推好晾干的骨髓片用甲醇溶液固定15min，取出晾干。将固定晾干后的骨髓片，用Giemsa应用液染色10~15min，轻微冲洗掉玻片上的染色液，置晾片架上晾干。显微镜观察并计数微核率。第73页,共87页，星期六，2024年，5月PCE呈灰蓝色，成熟RBC呈粉红色，NC呈蓝紫色。PCE中含有的微核大小为细胞直径的1/20-1/5，呈圆形或椭圆形，边缘光滑整齐，染色性与细胞核一致，呈紫红色或蓝紫色。一个细胞内可以出现一个或多个微核。每张片计数1000个PCE中含微核的PCE数。微核率（‰）=含微核PCE细胞数PCE细胞总数×1000第74页,共87页，星期六，2024年，5月Giemsa染色PCE胞质内含有核糖体，染色呈灰蓝色；MCN多数为圆形，嗜色性与核质一致，呈紫红色或蓝紫色NCE的核糖体已消失，被染成淡桔红色。NCEPCEMCN第75页,共87页，星期六，2024年，5月结果分析与评价本试验中只计数PCE中微核，微核率以千分率表示。PCE/NCE为评价细胞毒性的指标：正常PCE/NCE比值约为l（正常范围为0.6～1.2）；如PCE/NCE＜0.1，则表示PCE形成受到严重抑制；如PCE/NCE＜0.05，则表示受试化学毒物的剂量过大，试验结果不可靠。第76页,共87页，星期六，2024年，5月*结果示小鼠骨髓嗜多染红细胞中一个微核（MN）示小鼠骨髓正常嗜多染红细胞（NCE）第77页,共87页，星期六，2024年，5月*示小鼠骨髓嗜多染红细胞中两个微核（MN）第78页,共87页，星期六，2024年，5月*示小鼠骨髓嗜多染红细胞中多个微核（MN）第79页,共87页，星期六，2024年，5月显性致死指发育中的精子或卵子细胞发生遗传学损伤，导致受精卵或发育中的胚胎死亡。一般认为显性致死主要是由于染色体损伤的结果。显性致死试验以胚胎死亡为观察终点，用于检测受试物对动物性细胞的染色体损伤作用。一般采用性成熟的雄性大鼠或小鼠接触受试物，然后使之与未染毒的雌性交配，观察胚胎死亡情况。计算出受孕率、总着床数、早期和晚期胚胎死亡率予以评价。5.显性致死试验(dominantlethalassay)第80页,共87页，星期六，2024年，5月6.程序外DNA合成试验(unscheduledDNAsynthesistest，UDS)当DNA受损后，DNA的修复合成可发生在正常复制合成期(S期)以外的其他时期，称为程序外DNA合成。用同步培养将细胞阻断于Gl期，并将正常的DNA