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第一章mRNA纯化及片段化（PurifythemRNAandFragmentation）3
第二章c第一链合成（SynthesizetheFirstStrandc）5
第三章c第二链合成（SynthesizetheSecondStrandc）6
第四章末端修复（PerformEndRepair）7
第五章3末端加腺苷酸（Adenylate3Ends）8
第六章连接接头（LigatetheAdapters）9
第七章富集纯化的c模板（EnrichthecTemplates）11
第八章文库质检（QCthelibraries）13
第九章簇生成(ClusterGeneration)14
第十章上机（Sequencing）15
第十一章试剂和仪器（ReagentandEquipment）16
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第一章mRNA纯化及片段化（PurifythemRNAand
Fragmentation）
1.实验前注意事项
A、建议使用6-10μg纯化前的totalRNA用于纯化mRNA。
B、磁珠纯化用的AMPureXPBeads需要提前放置室温平衡30min。
C、AMPureXPBeads纯化时，加入洗涤磁珠需在磁力架上进行，
勿打散磁珠。
D、磁珠纯化吸去上清液时，勿将磁珠带出。
E、AMPureXPBeads纯化时所需的80%EtOH现用现配。
2.在1.5mlRNase-free离心管中加入3g纯化后的总RNA。用RNase-free
水调节体积至50μL。
3.充分震荡混匀RNAPurificationBeads。
4.加入50μL已混匀的RNAPurificationBeads到含有RNA的1.5mlEP管
中。用移液器轻轻吹打数次，直到混匀为止。
5.65°C金属浴中孵育样品5min。
6.从金属浴中取出样品，室温放置5min。
7.将含有磁珠与RNA的1.5mlEP管放置在磁力架上，等待5min，使磁
珠与磁力架充分吸附。
8.待上清液澄清后，弃上清液，将含有mRNA-Beads的1.5mlEP管从磁
力架拿起，加入200μLBeadWashingBuffer，充分混匀。然后再放置在
磁力架上吸附，等待5min。
9.弃掉上清液，在加入50μLElutionBuffer，充分混匀。
10.混匀后，80°C金属浴中孵育样品2min，使mRNA从磁珠上洗脱。
11.待样品冷却至室温，再加入50μL的BeadBindingBuffer至含有
mRNA-Beads的1.5mL的EP管中，充分混匀后室温放置5min。
12.将重新结合的EP管放置在磁力架上吸附5min，使含有mRNA的磁珠
充分吸附到磁力架一边，与上清分离。
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13.待上清液澄清，弃上清液，将含有mRNA-Beads的EP管从磁力架
上取下，加入200μLBeadWashingBuffer，充分混匀，然后再放置
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