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酶联免疫吸附试验(ELISA)

单向、双向免疫扩散实验酶联免疫吸附试验(ELISA)

课时安排

ELISA原理（双抗夹心）

单向（示教）、双向免疫扩散原理

ELISA包被

双向免疫扩散试验

酶联免疫吸附试验(ELISA)

ELISA(Enzyme-linkedimmunosorbentassay)

类型

抗体测定法

间接法检测特异性抗体

抗原测定法

直接竞争法检测可溶性抗原-测定小分子抗原

双抗体夹心法检测可溶性抗原-测定大分子抗原

双抗体夹心法——实验原理

ELISA双抗体夹心法(enzymelinkedimmunosorbentassay_sandwichtechnique)

将特异性抗体结合到固相载体上形成固相抗体，然后和待检血清中的相应抗原结合形成免疫复合物，洗涤后再加酶标记抗体，与免疫复合物中抗原结合形成酶标抗体-抗原-固相抗体复合物，加底物显色，判断抗原含量。

实验流程

包被捕获抗体

封闭

加入待检测样品

加入检测抗体

加入反应底物

读值

包被抗体

定义：将抗原或者抗体固定在固相载体的过程称为包被

抗体或者蛋白质抗原一般采用pH9.6的碳酸盐缓冲液作为稀释液（即本次实验用的coatingbuffer）

4-8℃包被过夜(有利于蛋白活性的保持）

37℃孵育2小时被认为具有相等的包被效果

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单向、双向免疫琼脂扩散

实验原理

可溶性抗原与相应抗体持异性结合，两者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下，经一定的时间，可形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应(precipitation)。沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、类脂等。

琼脂扩散(agardiffusion)为可溶性抗原与抗体在琼脂凝胶中所呈现的一种沉淀反应。

单向免疫扩散

双向免疫扩散

单向免疫扩散（示教）

单向琼脂扩散试验是一种定量试验，将抗体混合于琼脂内，倾注于玻片或平皿上，凝固后在琼脂上打孔，再将抗原标本加入孔内，经过一定的时间，在孔的周围出现抗原抗体复合物形成的沉淀环，环的大小与抗原含量和扩散时间相关。

双向免疫扩散——实验原理

双向免疫扩散是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散，彼此相遇后形成一定类型的特异性沉淀线，沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原抗体的特异性及相互间比例，而且与其分子大小和扩散速度相关。

实验步骤

每个孔均加样10μl