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丹青不知老将至，贫贱于我如浮云。——杜甫
PCR反应条件体系总结
PCR技术概论
聚合酶链反应(PolymeraseChainReaction,PCR)是80年代中期
发展起来的体外核酸扩增技术。它具有特异、敏感、产率高、快速、
简便、重复性好、易自动化等突出优点；能在一个试管内将所要研究
的目的基因或某一DNA片段于数小时内扩增至十万乃至百万倍,使肉
眼能直接观察和判断；可从一根毛发、一滴血、甚至一个细胞中扩增
出足量的DNA供分析研究和检测鉴定。过去几天几星期才能做到的事
情，用PCR几小时便可完成。PCR技术是生物医学领域中的一项革命
性创举和里程碑。
PCR技术简史
PCR的最早设想核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代
末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971
年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂
交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基
因”。
PCR的实现1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mulli
s等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体
内复制，只是在试管中给DNA的体外合成提供以致一种合适的条件--
-摸板DNA，寡核苷酸引物，DNA聚合酶，合适的缓冲体系，DNA变
性、复性及延伸的温度与时间。
PCR的改进与完善Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌
DNA聚合酶I的Klenow片段，其缺点是：①Klenow酶不耐高温，9
0℃会变性失活，每次循环都要重新加。②引物链延伸反应在37℃下
进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，
合成的DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传
统的基因扩增具备许多突出的优点，但由于Klenow酶不耐热，在DN
A模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成一个
丹青不知老将至，贫贱于我如浮云。——杜甫
扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术
在一段时间内没能引起生物医学界的足够重视。1988年初，Keohano
g改用T4DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实
性也较高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新
酶。1988年Saiki等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermusaqu
aticus)中提取到一种耐热DNA聚合酶。此酶具有以下特点：①耐高
温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的90%，在93℃下反应
2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原
来的40%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新
酶。③大大提高了扩增片段特异性和扩增效率，增加了扩增长度(2.0K
b)。
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