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DB21/TXXX—202X水质DNA条形码鉴定底栖动物

1适用范围

本标准规定了辽宁省河流中通过DNA条形码技术鉴定底栖动物的方法。本标准适用于辽宁省内河流中底栖动物的鉴定。

2规范性引用文件

本标准引用了下列文件或其中的条款。凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。

HJ710.8生物多样性观测技术导则淡水底栖大型无脊椎动物

3术语和定义

3.1

底栖动物Macrobenthos

指生活史的全部或大部分时间生活于水体底部、石块上或水草上的不能通过0.5mm（40目）孔径筛网的水生底栖大型无脊椎动物类群。

3.3

细胞色素C氧化酶亚基ICytochromecoxidasesubunitI，COI

细胞色素C氧化酶是线粒体基因编码的蛋白之一，由三个亚基组成，其中亚基I的基因具有种间距离明显大于种内遗传距离的特点，适合用于物种鉴定。

3.2

DNA条形码DNAbarcoding

一段标准的、短小的、有足够变异的且能够代表该物种的基因序列。本标准选用动物体内常用的COI基因作为DNA条形码序列。

3.3

聚合酶链式反应Polymerasechainreaction，PCR

一种用于放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，经30-40次循环可将特定的微量DNA大幅扩增。

3.4

降落PCRTouchdownPCR，TDPCR

一种相连循环退火温度逐渐降低的多循环PCR反应程序。由于前期退火温度高，引物结合难度增大，错配几率降低，目的片段的产率较低但准确率较高。后期随着退火温度的降低，前期积累的正确目的片段会被大幅扩增，使最终产物中目的片段的准确率大幅提高。

3.5

引物Primer

PCR反应中用于与目的DNA片段两端5’端结合的寡核苷酸。由于DNA聚合酶不能直接在模板链上合成DNA链，只能从引物的3’端开始延伸DNA链，因此DNA复制需要以

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引物作为起始。

3.6

退火Annealing

模板双链DNA经热变性、双螺旋解开成单链后，通过缓慢冷却到特定温度，使引物与该模板DNA单链重新配对，形成新的双链分子的过程称为退火。

3.7

琼脂糖凝胶电泳Agarosegelelectrophoresis

指以琼脂糖作为支持介质，带负电的DNA分子在电场作用下，向电场正极移动的现象。由于琼脂糖的分子筛效应，电场中DNA分子移动速度只与其分子量相关，可用于指示或分离不同分子量的DNA分子。

3.8

序列比对Sequencealignment

指运用特定的算法检测两个或多个序列之间的相似性，用于发现生物序列中的功能、结构和进化的信息。

3.9

系统发生树Phylogenetictree

又称演化树或进化树（Evolutionarytree），是用亲缘分支分类法表明具有共同祖先的各物种间演化关系的树。本方法采用的是邻近结合法（Neighbor-Joining，NJ）进化树。

3.10

遗传距离Geneticdistance

遗传距离指不同的种群或种之间的基因差异的程度，并以数值进行度量。

3.11

生物大分子序列比对有哪些信誉好的足球投注网站工具BasicLocalAlignmentSearchTool，BLAST

一种基于局部比对算法的有哪些信誉好的足球投注网站工具，可将输入的核酸或蛋白质序列与数据库中的已知序列进行比对，获得序列相似度等信息，从而判断序列的来源或进化关系。

3.12

分子进化遗传分析工具MolecularEvolutionaryGeneticsAnalysis，MEGA

一种用于分析物种亲缘关系、分子功能、遗传进化等的工具。可以实现序列比对和调参建树等功能。

4方法原理

使用苯酚-氯仿法提取底栖动物总DNA，SDS作为细胞裂解液先裂解细胞，通过苯酚和氯仿的反复抽提，使蛋白质等杂质留在有机相，DNA留在水相，进而分离得到总DNA。PCR反应可特异性的扩增正向引物和反向引物间的序列，经35次循环，目标COI序列可被扩增235倍。与DNA结合的EB会被紫外光激发发出强烈的橙红色荧光，与未结合的EB相比，荧光强度高几十倍，从而扩增的COI序列可被检测到。获得的COI序列经测序在NCBI或BOLD等公共数据库中有哪些信誉好的足球投注网站相似序列。将测序结果与有哪些信誉好的足球投注网站得到的序列一起绘制NJ进化树并

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计算遗传距离，一般遗传距离小于2%的认为是同一种。

5试剂和材料

除非另有说明，分析时均使用符合国家标准的分析纯试剂