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第二节抗原抗体的检测方法*凝集反应沉淀反应补体溶血反应和补体结合反应中和反应用标记抗体或抗原进行的抗原抗体反应一.凝集反应

(Agglutination)细菌、红细胞等颗粒性抗原与相应抗体结合后形成凝集现象，称为凝聚反应。直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面，与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。血球凝集**二.沉淀反应（Precipitation)血清蛋白质、细胞裂解液或组织浸液等可溶性抗原与相应抗体结合后出现沉淀物，这一类反应称为沉淀反应。沉淀反应可在液体中进行，如絮状沉淀。大多沉淀反应是用半固体琼脂凝胶为介质，进行琼脂扩散故也称免疫扩散。单向琼脂扩散试验火箭电泳双向琼脂扩散试验对流免疫电泳三.免疫标记技术*用荧光素、同位素或酶等示踪物质标记抗体（或抗原）进行抗原-抗体反应。标记物质与抗体（或抗原）的化学连接未改变抗体（或抗原）的免疫学特性，同时标记物的性质依然存在，因而极大的提高了反应的灵敏度，可以对微量物质进行定量、定性或定位检测。免疫标记技术主要有四种基本类型：免疫荧光技术、免疫胶体金标记技术、免疫酶技术和同位素标记技术。1.免疫荧光显微技术*用荧光素（常用的有异硫氰酸荧光素），与抗体连接成荧光抗体，再与待测标本的抗原反应，置荧光显微镜下观察，抗原抗体复合物散发出荧光，借此对标本中的抗原作鉴定和定位。包括直接荧光法、间接荧光法和补体法。12间接免疫荧光法示意图2.免疫荧光测定技术*用荧光抗体示踪或检查相应抗原的方法称荧光抗体法；用已知的荧光抗原标记物示踪或检查相应抗体的方法称荧光抗原法。因为荧光色素不但能与抗体球蛋白结合，用于检测或定位各种抗原，也可以与其他蛋白质结合，用于检测或定位抗体，但是在实际工作中荧光抗原技术很少应用，所以人们习惯称为荧光抗体技术，或称为免疫荧光技术。（1）时间分辨荧光免疫技术*原理：TRFIA是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物，如铕（Eu3+)来标记抗体、抗原，待反应体系发生后，用时间分辨荧光仪测定最后产物中的荧光强度，根据荧光强度和相对荧光强度比值，判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。优点：技术集酶标记、同位素标记技术的优点于一身，具有灵敏度高、特异性强、稳定性好、标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽和应用范围广泛等优点，量准确，务必在加样1小时内配制。Eu3+标记物的溶解和稀释必须尽注意：所用试剂和器材务必防尘；（2）电化学发光免疫分析技术*原理：电化学发光免疫分析技术是继放射免疫分析法、酶免疫分析法、荧光免疫分析法、化学发光免疫分析法后的最先进的免疫分析方法。电化学发光（ECL）是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应，实际上包括了电化学和化学发光两个过程。直接以[Ru(bpy)3]2+标记抗体，反应时标记物直接发光。且[Ru(bpy)3]2+在电极表面的反应过程可以周而复始进行，产生许多光子，使光信号得以增强。优点：非放射性标记物避免了放射性核素的污染；磁性微粒（2.8μm）为固相载体表面积大，吸附率高，近似均相免疫反应；链霉亲和素与生物素是最特异及牢固的结合；应用范围广；检测敏感度高；检测所需样本量少。2.酶免疫测定

(EnzymeImmunoassay,EIA)是用酶（常用的有辣根过氧化物酶HRP和碱性磷酸酶AP)标记的抗体进行的抗原抗体反应。EIA将抗原抗体反应的特异性与酶催化作用的高效性相结合，通过酶作用于底物后显色来判定结果。常用的方法有酶联免疫吸附试验和酶免疫组化法，前者测定可溶性抗原或抗体，后者测定组织或细胞表面的抗原。(1).酶联免疫吸附试验(ELISA)

将已知的抗原或抗体吸附在固相载体（聚苯乙烯微量反应板）表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。用洗涤法将液相中游离成分洗除。主要有双抗体夹心法、间接法BAS-ELISA等。(2)ELISA方法有:a.双抗体/抗原夹心法测抗原/抗体:包被在固相载体上的抗体/抗原与加入的待测抗原/抗体及酶标抗体/抗原三者在一定条件下进行温育反应，若待测样本中含有特异性抗原/抗体，则在孔内形成抗体/抗原-抗原/抗体-酶复合物,经过严格洗涤后,复合物与底物作用后将显色。将抗原包被在固相载体上，样本中含有特异性抗体则结合成抗原－抗体复合物，再与加入的酶标记抗抗体结合,形成抗原－抗体－酶标抗抗体复合物。酶催化底物显色。b.间接法测抗体：1C.竟争法测抗体：包被抗原于固相载