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氨基酸的鉴定(纸层析法)

1、掌握纸层析法的基本原理

2、通过对氨基酸的分离，掌握纸层析的操作方法并学会分

析未知样品中的氨基酸组分。实验原理：

1、层析法又称色谱法(Chromatography)，是一种物理的分离

方法。利用混合物中各组分物理化学性质的差异(如吸附办、分子

形状及大小、分子亲和力、分配系数等)，使各组分以不同程度分

布在固定相和流动相两相中，并使各组分以不同速度移动，从而

得到有效的分离。操作方式:纸层析、薄层层析、柱层析等。分

离机理:分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析、亲和

层析等。

2、纸层析法是用滤纸作为情性支持物的分配层析法，展层溶

剂由有机溶剂和水组成。滤纸纤维上的羟基具有亲水性，在滤纸

上水就被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。当有机溶剂(流动

相)

沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之

间不断进行分配。由于溶质中各组分的分配系数不同，移动速率

也不同，因而可以彼此分开。物质被分离后在纸层析图谱上的移

动速率用Rf值来表示：

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3、在一定条件下，物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质

的结构、性质、溶剂系统、层析滤纸的质量和层析温度等因素有

关。

4、本实验利用纸层析法分离氨基酸，利用茚三酮反应将氨

基酸层析点显色来鉴定氨基酸的种类。试剂：

1、酸性展层剂正丁醇：88%甲酸:水=15:3:2V/V

2、显色储备液：0、4mol/L茚三酮-异丙醇:甲酸:水

=20:1:5V/V

3、标准氨基酸溶液(6mg/ml,苯丙氨酸Phe、甘氨酸Gly、脯

氨酸Pro、组氨酸His)

4、未知样品液：上述4种氨基酸中的一种或几种混合液(每

组任选一个样品)实验器材：

1、滤纸

2、烧杯

3、剪刀

4、毛细管

5、层析缸

6、微量注射器

7、电吹风

8、保鲜膜操作方法：

1、点样

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1、量取30ml层析溶剂、1ml显色贮备液于层析缸中，混匀密

闭，静置。（展层缸洗净后应除去多余的水，否则会影响展层溶

剂的比例而影响展层）

2、戴好手套，在桌上铺好一层保鲜膜。取一张干净滤纸，

将其剪裁为18cm14cm。在纸的一端距边缘2cm处用铅笔轻轻划一

条直线，在此直线上等距离分出几个点作为点样原点。（点样操

作时应戴手套，防止样品及滤纸受污染）

3、用毛细管将标准氨基酸及未知样品分别点在点样点上，

每次点样后用电吹风冷风吹干再点下一次，点样点直径不超过

5mm。

2、层析与显色

1、将滤纸卷成圆柱形，用针线缝合或钉书针固定成圆筒状，

纸的两边不能接触。

2、将滤纸竖直放入盛有展层剂的层析缸中，迅速盖紧层析

缸盖(点样点的一端在下，展层剂液面需低于点样线1cm左右。

3、待溶剂前沿线距滤纸末端1~2cm(展层长度10cm，约2hr)

时，取出滤纸(需带上手套)

4、用铅笔将前沿线作一标记。剪去缝合线，电吹风热风吹

千(通风橱中进行)，即可见层析斑点。结果处理：用铅笔将层析

图谱上的斑点圈出，分别测量点样点到层析点中心和点样点到溶

剂前沿的距离。计算各种标准氨基酸的Rf值，并根据样品分离的

情况鉴定混合样品中氨基酸的组分。

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点样点1-His2-Phe3-Gly4-Pro5-A18距离/cm点样点到层析点

中心0、

85、

61、

63、

60、9/3、9/6、2点样点到溶剂前沿8、

68、

68、

58、

68、6Rf(His)=0、8/8、6=0、093Rf(Phe)=5、6/8、6=0、

651Rf(Gly)=1、6/8、5=0、188Rf(Pro)=3、6/8、6=0、419