TGXAS-虾肝肠胞虫检测 荧光定量PCR法编制说明.docx

团体标准《虾肝肠胞虫检测荧光定量PCR法》

（征求意见稿）编制说明

一、任务来源和起草单位

根据《广西标准化协会关于下达2021年第三十八批团体标准制修订项目计划的通知》（桂标协〔2021〕99号）文件精神，由广西水产科学研究院提出申报的团体标准《虾肝肠胞虫检测荧光定量PCR法》（项目编号2021-3802）已获立项。该团体标准由广西水产科学研究院提出、由广西水产技术推广站和广西水产科学研究院共同起草。

二、标准制定的目的和意义

虾肝肠胞虫(Enterocytozoonhepatopenaei，EHP)属于肠胞虫科、肠胞虫属的一种专性细胞内寄生的微孢子虫，在2004年最早发现于泰国养殖的斑节对虾并于2009年首次被分离和正式命名报道，主要感染凡纳滨对虾和斑节对虾等重要养殖虾类，是近10年危害养殖对虾的主要病原之一。EHP感染主要导致养殖对虾生长缓慢甚至停滞，表现为对虾消瘦、大小不均、重量离散；还可导致患病虾肝胰腺遭到破坏，免疫力降低，更容易被其他病原所侵染而死亡。目前，EHP已对全球对虾产业构成严重威胁，印度、委内瑞拉、中国、泰国、越南、马来西亚以及文莱等国家均有该病原检出并造成严重经济损失的报道。鉴于EHP引起的虾肝肠胞虫病（EHPD）的严重危害性，我国从2017年起已将EHPD纳入《国家水生动物疫病监测计划》，且规定阳性场处置参照一类疫病处置措施实施；近几年监测结果显示，我国沿海多省市的监测样品检出EHP阳性，检出品种包括凡纳滨对虾、斑节对虾、中国对虾、克氏原螯虾和青虾等我国主要养殖虾品种，表明EHP已成为我国虾类养殖业面临的重要威胁。EHP的危害与其感染数量密切相关，轻度感染基本上不影响对虾的生长发育，中度感染影响对虾的营养吸收，严重感染损坏对虾免疫系统。因此，非常必要建立一种快速且准确的EHP定量检测方法用于虾苗检疫、亲虾筛选、以及成虾养殖疫情监测过程中根据其定量数据及对虾养殖模式制定相应措施。

迄今为止国际(OIE)和国内均没有TaqMan-MGB荧光定量PCR检测虾肝肠胞虫的相关标准发布。荧光定量PCR(Real-timePCR)是在PCR反应体系中加入荧光标记物，通过仪器检测荧光信号强度对整个PCR反应扩增过程进行实时监测，在荧光信号指数扩增阶段PCR产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品绘制标准曲线，最后通过标准曲线对未知核酸模板进行定量分析的方法，具有速度快、灵敏度高、特异性强、自动化程度高、能定量检测病原体感染的强弱等优点，被认为是实验室检测病原体最理想的方法；而TaqMan-MGB探针则是荧光定量PCR使用的一种荧光探针，其3′端的淬灭基团为不发光的MGB(MinorGrooveBinder)结合物，可实现高Tm值的探针长度缩短易于与模板退火而利于提高方法的灵敏度，且探针3′端不发光的淬灭基团与5′端报告基团在空间的位置更接近，使荧光本底降低、实验结果分辨率更高，因此TaqMan-MGB探针凭借其技术优势已广泛应用于人及动植物各种病原体的定量检测。目前，检测EHP国内使用的方法为套氏PCR，相比较荧光定量PCR，其操作更繁琐，需要电泳步骤，增大交叉污染风险。就EHP的监测工作，建立敏感性高、特异性强、操作更简便的TaqMan-MGB荧光定量PCR方法并制定标准用于病原检测，对有效防控由EHP引起的虾病害具有重要意义。

三、标准的编制过程

1、成立编制工作组。团体标准《虾肝肠胞虫检测荧光定量PCR法》项目任务下达后，广西水产科学研究院会同广西水产技术推广站成立了此标准编制工作组，制订了编制总体工作方案及进度安排，确定了标准中主要内容草案，明确了任务分工及工作技术路线。

2、资料收集、方法建立。确定编制工作小组后即展开调查研究，收集资料，包括国内、区内已颁布的相关标准、国内公开发表的相关技术性资料。查阅是否有相关的荧光定量PCR方法应用于虾肝肠胞虫1的检测，经综合分析研判，编制人员根据分工，采购试剂、设计引物探针、结合项目组开展的相关科研和检测工作基础，收集已保存的虾虾肝肠胞虫病原，开展反复试验，进行标准品制备、敏感性、特异性、稳定性测试，初步建立虾肝肠胞虫TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法。

3、优化方法，形成征求意见稿。标准起草组成员在前期研究工作以及初步建立的方法上，将试剂浓度、各反应条件进行优化、改进，筛选最佳反应程序，建立标准的TaqMan-MGB探针荧光定量PCR方法，制定荧光定量PCR检测技术的操作规程，标准起草小组根据国家标准化相关法律、法规要求，参考国内相关文献资料以及技术标准资料进行编写起草标准文稿。经两家起草单位工作人员讨论修改，完成《虾肝肠胞虫检测荧光定量PCR法》团体标准的征求意见稿。

四、标准编制原则

1、实用性原则

本文件