《细胞生物学》流式细胞术、流式细胞仪-FACS-方法-教学课件（非AI生成）.ppt

（FlowCytometry,FCM)

*1、流式细胞仪(FlowCytometer):是集光电子物理，光电测量，计算机，细胞荧光化学，单抗技术为一体的高科技细胞分析仪。2、流式细胞术(FlowCytometry):利用流式细胞仪对处于快速流动的细胞或生物颗粒进行多参数、快速（每秒可达1000-10000个）的定量分析和分选（纯度可达99%以上）的技术。基本概念*流式细胞术发展史1030年Caspersson和Thorell开始致力于细胞的计数。1934年Moldaven是世界上最早设想使用细胞检测自动化的人，他试图用光电仪纪录流过毛细管的细胞。1940年Coons提出用结合了荧光素的抗体去标记胞内的特定蛋白。1949年Wallacecoulter提出在悬浮液中计数粒子的方法的专利。1953年红细胞光学自动计数器问世。1969年VanDilla发明第一台荧光检测细胞计。1972年Herzenberg研制出一个细胞分选器的改进型，能够检测出经过荧光标记抗体染色的细胞荧光信号。1975年单克隆抗体技术问世。*流式细胞仪结构?激光光源及光束形成系统?流动室及液流驱动系统?光学系统：透镜、滤光片、小孔，聚焦光源，收集不同波长的荧光信号。?信号检测与分析：光电倍增管（PMT）、补偿电路。荧光信号转换为电信号，并将信号放大。?存储、显示、分析系统：计算机。?细胞分选系统*流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统 激光光源 光收集系统电子系统 光电转换 数据处理系统*InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid*ForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser*90DegreeLightScatterFALSSensor90LSSensorLaser*DichroicFilter/MirrorFilterplacedat45oReflectedlightTransmittedLightLightSource*LaserFluorescenceDetectorsFluorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)PurdueUniversityCytometryLaboratories*流式细胞仪

分选系统488nmlaser+-ChargedPlatesSinglecellssortedintotesttubesFALSSensorFluorescencedetector*流式细胞术（FlowCytometry,简称FCM,又名FACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量工作原理*流式免疫分型技术要点标本的获取和运输标本的制备和染色仪器的校准和质控流式细胞仪数据获取与储存*细胞被戴上特殊的标记。所用的标记细胞的探针是能够同待分选细胞表面特征性蛋白(抗原)结合的抗体，而这种抗体又能够同某种荧光染料结合。被结合的细胞带上了荧光标记。当稀释的细胞进入超声波振荡器时，极稀的细胞悬浮液形成很小的液滴，一个液滴中只含有一个细胞。液滴一旦形成并通过激光束时，激光束激发结合在细胞表面抗体分子。*FCM的主要测定指标FSC,SSC,FL1,FL2,FL3(FL4)其中： FSC(Forwardscatter=前方散乱光)：反映细胞的大小 SSC(Sidescatter=側方散乱光)：反映细胞内颗粒性*FCM标记方法单标：一种单抗/tube:FL1,FSC,SSC（三参数）双标：（两种单抗/tube）：FL1,FL2,FSC,SSC（四参数）三/四标：（三种单抗/tube）（四种单抗/tube）： FL1-FL3/4,FSC,SSC*荧光素种类FITC(异硫氰酸荧光素）：绿色530nm（FL-1)PE（藻红蛋白）：橙黄色575nm(FL-2)PerCP(多甲藻黄素叶绿素蛋白）：深红色(FL-3) 675nmPI(碘化丙啶）：橙红色620nm 4