《遗传学》第19章 基因工程概论-教学课件（非AI生成）.ppt

***到2005年1月，共发现4342种限制酶和甲基化酶，其中限制酶有3681种，包括Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型限制酶各有59、3612、10种，甲基化指导的限制酶有3种，商业化的限制酶有588种，在Ⅱ型限制酶中共有221种特异性。

*******除上述的基本条件外，根据实验的需要，人们还常希望载体具有其他的各种特征。如携带外源DNA的幅度较宽，具备可促进外源DNA高水平表达的调控区；为保证安全，载体在特定宿主细胞外不能生存，以及某些特殊的筛选指标等等。**克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒4、噬粒5、人工染色体*1、质粒载体——复制起点来自一些天然质粒质粒的特点：大小：2-200kb存在于细菌中，偶见于链霉菌和酵母独立于染色体之外进行复制和遗传,又依赖于宿主编码的酶和蛋白质来进行复制和转录。比病毒还简单的亚细胞结构，一旦离开寄主细胞则无法繁殖。*1、质粒载体——复制起点来自一些天然质粒常用的两种质粒：PBR322质粒和PUC质粒（1）PBR322质粒概念：质粒载体PBR322是研究得最多，使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。

*1、质粒载体——复制起点来自一些天然质粒（1）PBR322质粒优点：1、质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小。2、2、它带有一个复制起始位点，保证了该质粒只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。3、具有两种抗生素抗性基因（氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因），可供转化子的选择标记（负选择法）。

4、质粒载体pBR322具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。*1、质粒载体——复制起点来自一些天然质粒（2）PUC质粒（PBR322的衍生质粒）与PBR322的异同：（1）PUC质粒保持了PBR322的复制起点（2）保留了氨苄青霉素抗性基因（3）增加了大肠杆菌乳糖操纵子的启动子和LacZ基因部分区段（可产生α肽）（4）新增了多克隆位点*1、质粒载体——复制起点来自一些天然质粒（2）PUC质粒（PBR322的衍生质粒）PUC质粒通过蓝白斑实验选择重组子经IPTG诱导LacZ酶催化X-gal后会使菌落变蓝，当外源基因插入目的基因多克隆位点之后，破坏了α肽的功能，该产物不能与宿主LacZ的N端有缺失的产物发生α互补，无LacZ酶活性，因此不能使X-gal变蓝，仍为白色菌落。*克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒4、噬粒5、人工染色体*2、噬菌体载体重组DNA技术中常用的噬菌体克隆载体主要有λ类噬菌体和M13噬菌体构建λ噬菌体载体的基本原理是多余限制位点的删除，按照这一基本原理构建的λ噬菌体的派生载体，可以归纳成两种不同的类型：一种是插入型载体（insertionvectors），只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。插入型载体只能承受较小分子量（一般在10kb以内）的外源DNA片段的插入，广泛应用于cDNA及小片段DNA的克隆。另一种是替换型载体（rePlacementvectors），具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的DNA区段可以被外源插入的DNA片段所取代。可承受较大分子量的外源DNA片段的插入，所以适用于克隆高等真核生物的染色体DNA。*2、噬菌体载体噬菌体载体和质粒载体优缺点比较：（1）噬菌体文库比质粒文库克隆容量大一倍；（2）噬菌体载体感染包装效率更高；（3）质粒DNA提取较为方便。*克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒4、噬粒5、人工染色体*3、黏粒——带有黏端位点(cos)的质粒黏粒是由人工构建的含有λ噬菌体DNA的cos序列和质粒复制子的载体。黏粒的组成包括质粒复制起点（ColE1）、氨苄青霉素抗性标记、cos位点。黏粒有4个特点：①具有λ噬菌体的特性。黏粒在克隆了外源DNA在体外包装成噬菌体颗粒后，可以感染宿主菌并在细菌内按照λ噬菌体DNA的方式环化起来。但黏粒载体不含有λ噬菌体的全部必要基因，因此不会使宿主菌裂解，无法形成子代噬菌体颗粒。②具有质粒的特性。黏粒具有质粒复制子，可在宿主菌内像质粒DNA一样进行复制。③克隆外源DNA的容量大。黏粒自身相对较小，一般只有5～7kb，而最大的克隆片段可达45kb左右。④能与有同源序列的质粒进行重组。*克隆载体的种类1、质粒2、噬菌体载体3、黏粒