微生物检验技术—病毒检验技术.pptx

1病毒分离与鉴定

2病毒分离和鉴定的一般程序临床标本的收集标本处理后接种新生小鼠组织鸡胚收获尿囊液、羊膜腔液红细胞凝集试验CPE红细胞吸附空斑试验包涵体EM观察发病

3组织细胞培养鸡胚培养动物接种一、病毒的分离方法

41.组织细胞培养根据细胞的来源、特性和传代次数分为：(1)原代细胞培养：将离体的新鲜组织器官经机械或胰蛋白酶处理，制成单个细胞悬液，加营养液在细胞培养皿中培养。原代细胞再用胰蛋白酶或EDTA等消化后加营养液继续培养，称次代细胞。

5(2)二倍体细胞株：原代细胞体外分裂50代仍保持二倍体特性，如人胚肺细胞。广泛用于病毒分离和疫苗制备。(3)传代细胞株：来于肿瘤细胞，染色体特征类似肿瘤细胞。常用的有人宫颈癌细胞(Hela)、人喉上皮癌细胞(Hep-2)。繁殖快，易于传代保存。只能用于病毒分离，不能用于疫苗制备。

6常用于病毒分离的细胞细胞种类可分离的病毒原代细胞非洲绿猴肾细胞人单核细胞人胚肾、肺细胞恒河猴猕猴肾细胞HSV、RSV、VZV、腮腺炎病毒、风疹病毒HIV、HTLV、HHV-6腮腺炎病毒、腺病毒ECHO、脊髓灰质炎病毒、柯萨奇A、B组、RSV二倍体细胞株人胚肺成纤维细胞株WI-38、MRC—5CMV、VZV、鼻病毒腮腺炎病毒、腺病毒传代细胞系HelaHep-2Vero柯萨奇A、B组、RSV腺病毒、RSVHSV、RSV、风疹病毒、轮状病毒、麻疹病毒

7正常细胞细胞病变效应CPE

8鸡胚是用于分离粘病毒科、疱疹病毒、痘类病毒的较为理想的材料。优点:有不同部位可以接种，易于病毒繁殖；来源充足，操作简便；通常是无菌的；对接种病毒不产生抗体。缺点:卵黄中含有抗家禽病原的抗体；可带有某些病毒如鸡白血病病毒；饲料中的抗生素也能传递给鸡胚。2．鸡胚接种

9鸡胚的接种方法卵黄囊接种羊膜腔接种尿囊腔接种绒毛尿囊膜接种脑内接种胚体接种

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11常用动物:动物十分重要。小鼠、乳鼠、家兔、豚鼠、猴等常用于分离病毒。接种部位:静脉、鼻咽腔、腹腔、脑内、皮内、皮下等。发病情况观察:食欲、活动及粪便情况；局部和全身变化;神经系统感染可出现震颤、松毛，软弱、不安、弓背、抽死亡；呼吸系统病毒可出现咳嗽、呼吸加快、少食等。不死，解剖后查病毒抗原，死亡，取病变组织传代和鉴定。3．动物接种

12病毒鉴定的方法1、病毒增殖后导致细胞形态变化:①细胞病变效应(CPE)：细胞肿大，变圆堆积成葡萄状，细胞溶解出现空斑。

13②多核巨细胞和包涵体。细胞融合形成多核巨细胞，胞浆内或核出现嗜酸性或嗜碱性包涵体等；2.红细胞吸附：血凝现象。3.细胞培养液pH的变化。

144.病毒的数量与感染性测定(1)空斑或蚀斑形成试验空斑是指在单层细胞中被病毒感染引起死亡的细胞区域，周围被活细胞包围。一般而言，一个空斑是由一个感染性病毒颗粒感染所引起的。

15蚀斑（plaque）测定蚀斑形成单位（plaqueformingunit,PFU）病毒的数量与病毒毒力测定。(2)50%感染量或50%组织感染量（ID50或TCID50）测定：用来估计病毒感染的强弱程度。

164.其他实验(1)干扰现象:某些病毒间存在着干扰现象，如某些型别的鼻病毒能干扰以后进入的副流感病毒的增殖，从而阻抑后者的红细胞吸附作用。

17(2)耐酸试验肠道病毒对酸有耐受力，而鼻病毒在酸性环境下易被灭活。(3)乙醚敏感试验病毒外围如有类脂包膜，则易被乙醚破坏，而失去感染性，不能感染细胞。可作为病毒是否具有类脂包膜的依据，也可用氯仿或去胆酸钠代替乙醚进行试验。

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一、血清学诊断方法

（一）抗原的检测：病毒抗原是病毒特异性的标志，通过免疫学技术检测标本中特异性抗原存在，可以早期诊断病毒感染。病毒血清学诊断及其他快速诊断方法

191．免疫荧光技术适合于型别少，细胞培养难以成功的病毒，如流感病毒、副流感病毒、疱疹病毒、巨细胞病毒、腺病毒等。肝活检组织中的肝炎病毒、神经组织中的单纯疱疹病毒、脑组织中的狂犬病毒或其他脱落细胞和活检组织中的病毒抗原检测。

202．酶免疫技术有酶免疫组化和酶免疫吸附(ELlSA)试验法。测定标本中游离的抗原或抗体。如检测乙型肝炎病毒的表面抗原(HBsAg)，HIV感染病人的P24抗体等。

213.其他技术如固相放射免疫技术、发光免疫分析技术、胶体金标记的免疫层析技术