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双向电泳的操作2007-7-4样品制备（Samplepreparation）1固相pH梯度胶条的水化（IPGstriprehydration）2第一向等电聚焦（IEF）3第一向胶条的平衡（IPGstripequilibration）4第二向SDS电泳（SDS）5检测染色（Detection/Staining）6蛋白点的挖取，收集7质谱分析8步骤总的策略http://01蛋白质组学导论生物学的新工具(2005)D.C.利布莱尔著02蛋白质化学与蛋白质组学(2004)夏其昌编著03参考资料1破坏蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态32减少对蛋白质的人为修饰尽可能的提高样品蛋白的溶解度，抽提最大量的总蛋白，减少蛋白质的损失一般性原则尿素（Urea）和硫脲（thiourea）离液剂(chaotropes):NP-40、TritonX-100等非离子去垢剂CHAPS与Zwittergent系列等双性离子去垢剂表面活性剂（sufactants）也称去垢剂：二硫苏糖醇（DTT）二硫赤藓糖醇（DTE）磷酸三丁酯（TBP）还原剂（reducingagents）Tris-base蛋白酶抑制剂（如EDTA、Pefablocproteaseinhibitor、PMSForProteaseinhibitorcocktails）核酸酶选择性的加入样品制备需要的试剂影响蛋白质可溶性和2DE重复性的物质核酸超声或核酸酶处理脂多糖超速离心除去盐类小分子透析可以降低盐浓度，但时间太长采取凝胶过滤或沉淀/重悬法脱盐，但会造成蛋白质的部分损失。Urea01Thiourea02CHAPS03DTT04PharmalytepH3-1005Tris-Base06Pefablocproteaseinhibitor071%SDS08常用裂解液培养细胞的收集；01用磷酸缓冲液（PBS）洗细胞3次（室温，1000g，各2min）；02将细胞分装到1.5mlEppendof管中，吸干残留的PBS；03加入裂解缓冲液（1.5x106个细胞大约加入100μL裂解液），在室温振荡1h，使其充分溶解；044℃，40,000g，离心1h；05吸取上清并用Brandford法定量蛋白，然后分装至Eppendof管里保存在-78℃备用。06培养细胞（culturecell）样品处理方法样品制备程序组织样品处理方法三氯醋酸－丙酮沉淀法（TCA/acetoneprecipitation）超速离心法BACK12加样品水化A不加样品水化BIPG胶条的水化加样品水化加样品水化BACK限流50uA200V1hr500V1hr1000V1hr8000V30mingradient8000V5hr(40000Vh)500V维持BACK0102IEFIPGstripequilibrationBACK分装40ml贮存于-20℃这是一个贮存液。用之前在加1%DTT或者2.5%碘乙酰胺。第二向SDS电泳（SDS）BACK