酶的测定(详细).pdfVIP

君子忧道不忧贫。——孔丘

一、脲酶测定(比色法)

1.方法原理

脲酶广泛存在于土壤中，它能酶促尿素分解生成氨、二氧化碳和水。测定脲酶的方法很

多，包括比色法、扩散法、电极法等，其中比色法最为常用。现介绍苯酚一次氯酸钠比色法，

该方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚次氯酸钠作用(在碱性溶液中及在亚硝基铁氰

化钠催化剂作用下)生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。

2.试剂配制

（1）pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化钾溶于

水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2）苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后用乙

醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），

保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3）次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。

（4）10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5）N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN的标

液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

3.操作步骤

取5g风干土置于50mL三角瓶中，加1mL甲苯。15min后加10mL10％尿素溶液和

20mLpH=6.7柠檬酸盐缓冲液。摇匀，37℃恒温箱中培养24h。过滤，取1mL滤液注入50mL

容量瓶中，然后按配制标准曲线显色方法进行比色测定（为了消除土壤中原有的尿素而引起

的误差，每一土壤需做无基质对照，整个试验需做无土壤对照。）。

标准曲线配制：分别取0、l、3、5、7、9、11、13mL氮工作液，移于50mL容量瓶中，

然后加蒸馏水至20mL。再加4mL苯酚钠溶液和3mL次氯酸钠溶液。随加随摇匀。20min

后显色，定容。lh内在分光光度计上于波长578nm处比色。根据吸光值与氮溶液浓度绘制

标准曲线。

4.结果计算

以24h后lg土壤中NH3一N的质量(mg)表示脲酶活性(Ure)：

Ure=a·V·n／m

式中：a为由标准曲线求得的NH3一N浓度(mg／mL)；

V为显色液体积(50mL)；

n为分取倍数；

m为烘干土重(g)。

君子忧道不忧贫。——孔丘

二.过氧化氢酶测定(容量法)（比较好测）

1.试剂配制

（1）0.3％过氧化氢溶液：按1:100将30%H2O2用水稀释

（2）3N硫酸：168ml浓硫酸定容于2L容量瓶

（3）0.1N高锰酸钾（1/5KMnO4）溶液：称取化学纯高锰酸钾3.161g，溶于1升无CO2

蒸馏水中，贮于综色瓶中，备用。

（4）草酸钠（标定1/5KMnO4）：105~110℃烘至恒重，称取0.2g（准至0.0001g），溶于

100mL（8+92）硫酸溶液中。

2.操作步骤

取2g风干土，置于100mL三角瓶中，并注入40mL蒸馏水和5mL0.3％H2O2溶液。（同

时设置无土对照）。振荡20min