第7章发酵工程制药二ppt课件.pptxVIP

第九节

基因工程在发酵工程中的应用;以天然产物为基础发展药物的方法;基因工程改造传统制药工业

体现在四个方面;直接从自然界分离得到的菌株为野生型菌株。;微生物基因工程育种;（一）抗生素生物合成基因的特点及其克隆的策略和方法;阿克拉霉素Aclacinomycin;⑶少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质粒上

如天蓝色链霉菌3(2)菌株中的次甲霉素A（MethylenomycinA）的生物合成基因位于SCP1质粒上。;抗生素生物合成基因群成员的结构特点

⑴链霉菌抗生素生物合成基因群成员的DNA组成：GC含量高达70％以上、三联体密码子中的第三个碱基的GC比例极高；

⑵抗生素生物合成基因成簇存在：参与每种抗生素生物合成的基因约10－30个；

⑶少数抗生素的生物合成基因簇存在于游离状态的质粒上。;7个利用质粒和噬菌体载体来克隆抗生素生物合成基因簇的方法，利用这些策略已经克隆了不同类型抗生素的生物合成基因。这7个方法是：

在标准宿主系统中克隆检测单基因产物

阻断变株法

突变克隆法

直接克隆法

克隆抗生素抗性基因法

寡核苷酸探针法

同源基因杂交法

;⑴在标准宿主系统中克隆检测单基因产物

“鸟枪法”克隆基因：能够检测到单酶基因的产物。;鸟枪法克隆目的基因的基本战略;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;放线紫红素阻断突变株之间的互补测验;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;【突变克隆法原理图解】;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;⑷直接克隆法抗生素生物合成基因成簇存在，总长度～30kb，成套克隆基因簇是可能的。;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;2、克隆抗生素生物合成基因的策略和方法;;EliLilly公司首先根据催化泰乐星生物合成的最后一个步骤的大环菌素-O-甲基转移酶(Macrocin-0-methyltransferase)氨基端35个氨基酸顺序，按照密码子偏爱原则合成了44bp的寡核苷酸探针；

用?Charon4构建弗氏链霉菌的gDNA文库，与探针逐一杂交，10个重叠克隆共涉及27kbDNA；

与用粘粒pKC462a构建的弗氏链霉菌的gDNA文库杂交，有4个重叠克隆共包含58kb片段，其中包括前面的27kb片段；

进一步分析表明，58kbDNA中编码Tylosin生物合成全部基因。;;化学结构类似的抗生素，其生物合成途径和每个合成环节的酶也相似，编码酶的基因之间存在同源性；

用放线紫红素的actⅡ和actⅣ做探针，与24种产氨基糖苷类抗生素的链霉菌DNA杂交，可产生特异性杂交带；

用actⅡ为探针，成功地克隆了榴菌素(granaticin)和杀螨菌素(milbemycin)的生物合成基因簇；

利用红霉素的eryA1基因克隆了苦霉素(picromycin)生物合成相关基因；

利用碳霉素(carbomycin)的carE基因克隆了麦迪霉素的4-羟基苯酰基转移酶基因；;抗生素生物合成是由初级代谢产物经过一系列酶催化产生的次级代谢产物，其形成是一个复杂的，多因素的调节过程，抗生素的生物合成基因簇构成了对抗生素产生的最低水平的调节和控制。

放线紫红素

红霉素

青霉素

链霉素;（三）提高抗生素的产量;（三）提高抗生素的产量;（三）提高抗生素的产量;（三）提高抗生素的产量;1、将产生菌基因随机克隆到原菌株直接筛选高产菌株

2、增加参与生物合成种限速阶段基因的拷贝数

3、发挥调节基因的作用

4、增加抗性基因的拷贝数;（四）改善抗生素组分;（五）改进抗生素生产工艺;生物合成途径中某个酶基因的突变

在生物合成途径中引入一个酶基因

利用底物特异性不强的酶催化形成新产物;;二、基因工程在氨基酸和维生素生产中的应用

㈠在氨基酸生产中的应用;赖氨酸和苏氨酸协同反馈抑制;互补试验原理图示;顺反效应（cis-transeffect）;顺反测验图解;复习题

1、现代生物技术改造传统制药工业体现在哪四个方面？

2、抗生素生物合成基因群成员的三个结构特点。

3、简要说明提高抗生素的产量的四项措施。

4、为什么增加抗性基因的拷贝数可以提高工程菌的抗生素产量？