溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定.pdfVIP

百川东到海，何时复西归?少壮不努力，老大徒伤悲。——汉乐府

溶菌酶的提取,分离纯化,产物纯度鉴定及活性测定

溶菌酶的提取，分离纯化，产物纯度鉴定及活性测定

实验目的：

1、学习和掌握溶菌酶的制备过程

2、学习和掌握溶菌酶的纯化过程

3、学习和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的德原理和技术

4、测定溶菌酶的分子量和所提取的溶菌酶的浓度

5、测定所提取的溶菌酶的活性

试验原理：

溶菌酶（lysozyme）又称胞壁质酶（muramidase）或N-乙酰胞

壁质聚糖水解酶（N-acetylmuramideglycanohydrlase），是一种

能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞

壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖

分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶于

水，不溶于乙醚和丙酮，pI为11.0-11.35，最适pH值6.5。酸性介质

中可稳定存在，碱性介质中易失活。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋

白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。因

此，该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。

该酶广泛存在于人体多种组织中，鸟类和家禽的蛋清、哺乳动物

的泪、唾液、血浆、尿、乳汁等体液以及微生物中也含此酶，其中以

蛋清含量最为丰富。从鸡蛋清中提取分离的溶菌酶是由18种129个氨

基酸残基构成的单一肽链。它富含碱性氨基酸，有4对二硫键维持酶

构型，是一种碱性蛋白质，其N端为赖氨酸，C端为亮氨酸。可分解

溶壁微球菌、巨大芽孢杆菌、黄色八叠球菌等革兰阳性菌。

2.1、离子交换层析

离子交换层析是依据混合样品中各种离子或离子化合物与离子交

换树脂的可交换离子之间的交换程度不同而进行分离纯化的。离子交

换层析主要是离子交换剂与溶液中离子或离子化合物以离子交换方式

进行，过程是可逆的。由于离子交换剂对溶液中各种离子具有不同的

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结合力，也就是说，离子交换剂对各离子的排斥和阻滞作用不同，从

而引起各离子在柱内的流速差异，逐渐发生分离，最终分别流出层析

柱。该法可同时分析多种离子化合物，具有灵敏度高，重复性、选择

性好，分离速度快等优点。本实验分离溶菌酶采用732型弱酸性阳离

子交换树脂。

2.2、盐析

中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐

浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶。当盐浓度继续升高时，

蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量

盐加到蛋白质溶解中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的SO42-和NH4+）

有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之失水，于是蛋白

质胶粒凝结并沉淀析出。盐析是若溶液pH在蛋白质等电点则效果更好。

由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度

也不一样。溶菌酶在32%硫酸铵盐浓度下的沉淀最多，最适宜作为盐

析液浓度。经盐析得到的沉淀为溶菌酶的粗制品。

2.3透析脱盐

将此透析袋浸入水或缓冲液中，样品溶液中的大分子量的生物大

分子被截留在袋内，而盐和小分子物质不断扩散透析到袋外，直到袋