6 流式细胞术的质量控制和影响因素课件.ppt

6流式细胞术的质量控制和影响因素2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：在溶液较稀时，荧光强度与浓度成正比关系，随浓度加大，荧光强度也增大，当荧光染料达到一定浓度时，如继续增加浓度不仅不会使荧光强度有相应的增加，反而使荧光强度减低，这种因染料浓度增大使荧光量子的产额下降的现象称为浓度猝灭现象6流式细胞术的质量控制和影响因素2.荧光染色液的浓度与荧光发射强度有直接比例关系：因此在研究浓度与荧光强度关系时，必须检查所得的荧光值是曲线高峰前的浓度，还是曲线高峰后的浓度(方法是减少溶液浓度，如荧光减弱则为高峰前浓度)。鉴于荧光染料浓度对荧光强度的影响之大，因此要选择最合适的浓度，对于荧光定量检测技术是极其重要的6流式细胞术的质量控制和影响因素3.pH值对荧光发射强度的影响：荧光分子在溶剂中处于离子化状态，因此，溶液中的氢离子浓度对荧光强度影响极大，荧光分子发光的最有利条件是其在溶剂中呈离子化或极化状态，从而通过染料分子本身所具有的斥力作用尽可能避免分子之间的相互碰撞作用，每一种荧光分子都有自己合适的pH值6流式细胞术的质量控制和影响因素4.其他一些影响荧光强度的因素：像醛类固定剂(戊二醛，甲醛),可以干扰荧光染料与核酸分子的结合,像溶剂中的一些不发光的物质(如溴化物、碘化物、氨基苯、硝基苯、铁、银离子等)均可造成荧光的猝灭现象6流式细胞术的质量控制和影响因素六、流式细胞分析资料处理的质量控制样品中的碎片杂质和团块过多，所测细胞数仅占20%以下，组方图的基线抬高，尤其不能进行细胞周期分析，尽管目前有计算机的硬件删除或软件补偿来消除碎片和团块的影响，也应放弃不作分析处理6流式细胞术的质量控制和影响因素六、流式细胞分析资料处理的质量控制一个样品细胞数检测应在1万个细胞(不包括碎片、杂质、团块)。如果单独作DNA倍体分析而不作细胞周期的处理，小于1万个细胞也可以，但异倍体细胞占总细胞数的10%以下时，不可盲目下结论，至少异倍体细胞占总细胞的20%以上，可以确定异倍体的存在6流式细胞术的质量控制和影响因素流式细胞术的质量控制和影响因素6流式细胞术的质量控制和影响因素一、标本的采集和固定方法的质量控制标本采集是十分重要的环节，在标本的采集过程，需注意：①手术切除的新鲜标本或活检针吸标本取材时，要避免出血坏死组织。②标本采集后要及时固定或深低温保存，以免组织发生自溶，DNA降解，而造成测试结果的误差。③固定剂要采用对组织细胞穿透性强的浓度。6流式细胞术的质量控制和影响因素例如70%的乙醇固定比75%以上的浓度固定效果好，因为高浓度的乙醇常造成细胞表面快速形成一个蛋白膜，致使细胞内的物质固定不良。有作者分析研究了自溶对DNA测定的影响，发现自溶的组织细胞常出现假性异倍体，且不固定的组织细胞随时间的延长，DNA含量呈梯度降低6流式细胞术的质量控制和影响因素根据检测的目的，选择什么类型的固定剂，对流式检测质量也有显著的影响。例如细胞DNA的分析，使用醇类固定剂较好而不选择醛类固定剂，醛类固定剂明显影响细胞DNA荧光发射强度。实验证明，醛类固定剂对插入性荧光染料与核酸的结合有很强的干扰作用，其荧光强度仅相当于新鲜组织荧光强度的50-70%左右。6流式细胞术的质量控制和影响因素如果作流式免疫研究工作，采用新鲜组织是最好的选择。在不能及时检测又没有低温保存条件时，要根据所测物质在细胞内还是在细胞膜表面，在膜表面的抗原物质，以醛类固定剂为宜，尽管醛类固定剂产生的非特异性荧光较强，但不宜采用醇类固定剂，因醇类固定剂可使细胞表面的糖蛋白、脂蛋白脱落丢失，失去标记的位点。6流式细胞术的质量控制和影响因素如所测抗原物质在细胞内，可以使用醇类固定剂，这种固定方法简便易行，无需特殊低温冷冻条件，在一般冰箱(0-4℃)放置即可，能很好的保持细胞形态和生物化学成分不发生变性。6流式细胞术的质量控制和影响因素二、单细胞悬液制备的质量控制人体的末梢血液和骨髓细胞及淋巴组织是人体组织中缺乏细胞间连结装置的组织，尤其是血和骨髓细胞是天然的单分散细胞材料，其中的细胞成分在生理状态下呈单分散状态，它是流式分析最合适的样品来源。6流式细胞术的质量控制和