免疫标记技术及分析应用.pptVIP

酶及其底物酶底物显色反应测定波长辣根过氧化物酶邻苯二胺

四甲替联苯胺

氨基水杨酸

邻联苯甲胺

2,2‘-连胺基-2(3-乙基-并噻唑啉磺酸-6)铵盐橘红色

黄色

棕色

兰色

蓝绿色492460449

425

642碱性磷酸酶4-硝基酚磷酸盐(PNP)

萘酚-AS-Mx磷酸盐+重氮盐黄色

红色400

500葡萄糖氧化酶ABTS+HRP+葡萄糖

葡萄糖+甲硫酚嗪+噻唑兰黄色

深蓝色405420β-Ｄ－半乳糖苷酶甲基伞酮基半乳糖苷(4MuG)

硝基酚半乳糖苷(ONPG)荧光

黄色360,450

420DNM-9602G酶标分析仪DNM-9602标配酶标分析仪DNM-9602A酶标分析仪酶标分析仪测定OD值ELISA种类直接法间接法夹心法竞争法捕获法5.4.3.2.1.直接法返回2.间接法间接法是检测抗体最常用的方法，其原理为利用酶标记的抗抗体以检测已与固相结合的受检抗体，故称为间接法。+++间接法ELISA过程包被固相载体:用已知抗原包被固相载体加待检标本:使相应抗体与固相抗原结合洗涤，除去无关的物质加酶标抗抗体:与固相载体上抗原抗体复合物结合；洗涤，除去未结合的酶标抗抗体加底物显色根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定3.夹心法：+++双抗体夹心法双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法获得待分析物的未标定抗体将特异性抗体与固相载体连接形成固相抗体洗涤除去未结合的抗体及杂质加入封闭蛋白溶液以封闭载体表面残留的蛋白结合位点洗涤并除去未结合的封闭蛋白加受检标本（抗原）形成固相抗体－抗原复合物洗涤除去其他未结合的物质加酶标抗体生成抗体—待测抗原—酶标记抗体的复合物彻底洗涤未结合的酶标抗体加底物进行酶催化反应根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量测定双抗体夹心法双抗原夹心法原理标记抗原待测抗体包被体包被抗原双夹心法返回4.竞争法竞争法的原理固相支持物表面待测物包被抗体标记抗原此法可用于抗原和半抗原的定量测定，也可用于测定抗体。用已知特异性抗体包被固相载体测定管加待测抗原和一定量的酶标抗原使二者与固相抗体竞争结合对照管只加一定量酶标抗原与固相抗体直接结合分别洗涤除去未结合的成分加底物显色分别测定两管的吸光度值，根据对照管与测定管吸光度值之比，计算标本中待测抗原含量俘获抗体（二抗）待测抗体标记抗原包被体5.捕获法血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗本多用捕获法间接法直接法将荧光素标记在第二抗体（抗抗体）上或标记在SPA上，检测与抗原结合的特异性抗体。间接法直接法将荧光素标记在补体的抗体上（抗C3抗体），检测抗原抗体复合物。补体荧光染色法01优点：可检测所有的抗原抗体系统，具通用性；敏感性高。缺点：操作流程长、干扰因素多、非特异性荧光多，补体易失活、需新鲜制备不方便。02EnzymeImmunoassay（EIA）第三节就是将抗原和抗体的特异性免疫反应与酶的催化反应相结合而建立的一种免疫检测技术。抗原抗体反应＋酶催化反应1肉眼、光学显微镜、电子显微镜、分光光度计2特异、敏感3可以在细胞或亚细胞水平上示踪抗原或抗体的所在部位，或在μg、甚至ng水平上对其进行定量。4将酶分子与抗体或抗抗体分子共价结合，酶标记抗体可与存在于组织细胞或吸附于固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合。1滴加底物溶液后，底物可在酶作用下催化底物水解、氧化或还原等反应，产生有颜色的物质。酶降解底物的量与呈现的颜色成正比。2灵敏度高，特异性强；01试剂来源广，稳定，保存时间长，且无同位素污染；03操作简便，易于掌握和使用，且重复性好；05可定性、定量检测可溶性抗原和抗体，适用于普查；02结果可肉眼半定量，也可用仪器定量检测，且仪器价格较低廉，可在大多数实验室开展；04可用于定位组织细胞上的抗原或抗体成分。06优点：缺点：标记反应较难掌握，在操作过程中容易引起酶、抗原或抗体的失活。酶活性高；具有抗原抗体共价结合的基团；标记后不影响酶活性及抗原、抗体反应性；产物易判定或测定；酶活性不受样品中其他成分的影响（用于均相测定的酶标抗原与抗体结合后酶活性出现抑制或激活）；无害；稳定，价廉、易得。常用酶底物显色

辣根过氧化物