克隆载体的特征及类型.ppt

pUC18也来自于pBR322，但只保留了复制起点和ampR位点，ampR基因的序列已改变限制性位点不再存在，所有的克隆位点集中在lacZ基因内的一个小片段上。pUC18的优点：

1）突变位点位于复制起点，提高了拷贝数。

2)重组子的鉴定可一步完成，固体培养基中添加amp和X-gal,IPTG，节约了一半的时间。

3）多克隆位点，可以使具有不同粘端的DNA片段插入载体，而不必连接linker。

4）载体中的多克隆位点与M13mp系列的载体是相同的，因此，插入pUC系列的克隆DNA可以直接转入M13mp载体，可以进行DNA测序和体外定点突变。质粒重要的大肠杆菌质粒载体pGEM-3Z：多拷贝装有两个噬菌体的强启动子装有多克隆位点（MCS）正选择颜色标记lacZ’用于外源基因的高效表达注意：T7和SP6启动子特异性地由噬菌体DNA编码的RNA聚合2743bpMCSlacZ’PT7oriAprpGEM-3EPSP6酶所识别，因此相应的受体菌必须表达噬菌体RNA聚合酶，如：E.coliBL21（DE3）等在重组的pGEM3Z载体中加入相应的RNA聚合酶，可以发生外源基因转录。质粒质粒DNA的分离纯化实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA：氯化铯密度梯度离心法质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染碱溶法质粒DNA纯度底、快速、操作简便沸水浴法质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间质粒DNA的分离纯化氯化铯密度梯度离心法：用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体加溶菌酶裂解细菌细胞壁加CsCl和溴乙锭超速离心过夜在紫外灯下吸取cccDNA稀释沉淀cccDNAproteinsocDNADNAcccDNARNAs质粒操作简便克隆容量有限（10kb）02质粒载体总体评价01噬菌体或病毒是一类非细胞微生物，能高效率高特异性地侵染01宿主细胞，然后或自主复制繁殖，或整合入宿主基因组中潜伏02起来，而且在一定的条件下上述两种状态还会相互转化。03噬菌体或病毒的上述特性使得它们的DNA能被开发成为基因工04程的有用载体：05高效率的感染性能使外源基因高效导入受体细胞06自主复制繁殖性能使外源基因在受体细胞中高效扩增07第三节噬菌体或病毒DNA噬菌体或病毒DNA01040203l噬菌体由外壳包装蛋白和l-DNA组成l-DNA全长48502个核苷酸l噬菌体的生物学特性：生物结构大肠杆菌的l噬菌体DNAl-DNA上至少有61个基因约有20kb的区域为为噬菌体生长非必需的，可以缺失或被外源DNA片段所取代。l噬菌体生物学特性：生物结构5’TCCAGCGGCGGGG3’3’CCCGCCGCTGGA5’COSCOScos头部合成基因尾部合成基因溶菌控制基因晚期控制基因DNA合成控制基因阻遏基因早期控制基因阻遏基因重组基因删除与整合基因l-DNA野生型入噬菌体DNA为双链线性分子黏性末端(cohesiveend)：线性分子左右两端各有12bp组成的5端突出的粘性末端，?DNA进入宿主细胞后黏性末端连接形成环DNA分子。cos位点(cohesiveendsite)：指在连接酶的作用下，连接上述黏性末端结合形成的双链DNA区段。又称黏性末端位点。l噬菌体DNA分子上有56种限制性核酸内切酶识别位点。温和噬菌体，易于在溶源生长保存，在溶菌生长增殖。噬菌体生物学特性：生物结构噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：感染周期E.coli吸附LamB受体注入复制包装裂解噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体生物学特性：感染周期体内包装100个左右的拷贝包装范围为原DNA的75-105%即36-51kbDA大肠杆菌的l噬菌体DNAl噬菌体感染大肠杆菌后，除能裂解细胞外，也可能将其DNA直接整合到宿主细胞的染色体DNA上，并不产生子代噬菌体颗粒，这种情况为溶原状态。整合主要由l-DNA上的cI和int两基因的产物所激活，而这两个基因的开放与关闭又取决于宿主细胞本身的性质。人们可以根据需要改变l-DNA或宿主细胞的性质，使噬菌体或处于溶菌状态，或处于溶菌状态DNA重组技术一般需要l噬菌体进入溶菌状态l噬菌体生物学特性：溶原状态噬菌体或病毒DNA大肠杆菌的l噬菌体DNA野生型l-DNA包装的上限为51kb，本身长度为48.5kb，只有当插入的外源DNA片段不大于2.5kb时，才能