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饭疏食，饮水，曲肱而枕之，乐亦在其中矣。不义而富且贵，于我如浮云。——《论语》

CHO细胞定点整合稳定表达治疗性蛋白质的研究

中国仓鼠卵巢（Chinesehamsterovary,CHO）细胞是首个被美国FDA、欧

盟EMA和中国CFDA认可的用于生物制药领域的生产细胞,已广泛应用于各种治疗

性蛋白质药物的大规模制备。CHO细胞在治疗性蛋白质药物生产中的优势明确,

但目前构建重组的生产型CHO细胞株还一直停留在目的基因随机整合,或基于外

源基因倍增策略,通过筛选高表达细胞,以最终获得工程化表达细胞的研究思路。

这导致建立的生产型CHO细胞株的表达性状的长期稳定性欠缺,构建生产型

细胞株的效率低等问题。本研究以具有抗凋亡能力的CHO细胞株为研究材料,通

过对稳定表达外源性基因位点的确认,构建了可以表达不同类型治疗性重组蛋白

质的CHO表达细胞株,并对不同蛋白质类药物的表达稳定性进行了认证,主要结

果如下:（1）以CHO-K1细胞系为研究材料,采用CRISPR/Cas9技术,通过

CD513B-Cas9、sgRNA-BAK与sgRNA-BAX三个表达质粒一次性共转染,实现了对出

发细胞凋亡相关基因的敲除。

DNA序列测序发现实验细胞的目标靶点处序列均有明确的插入/删除;检测

实验细胞均不再表达BAK与BAX蛋白质。对比野生型CHO-K1细胞,发现构建的

BAKsup-/sup/BAXsup-/supCHO-K1细胞在抗凋亡能力方面有明显的优

势。

其中野生型CHO-K1细胞在5mg/L细胞凋亡促进试剂嘌呤霉素处理48小时

后,细胞的晚期凋亡比例从13.3%增加到了41.3%,而获得的3个

BAKsup-/sup/BAXsup-/supCHO-K1细胞克隆的晚期凋亡比例维持在

14%sup1/sup9%。选取BAKsup-/sup/BAXsup-/supCHO-K1（1d4）单

克隆细胞与CHO-K1细胞,经悬浮驯化,进行批次培养,CHO-K1与

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BAKsup-/sup/BAXsup-/supCHO-K1细胞可达到的最高密度（6×

10sup6/supcells/mL）相近;相较于CHO-K1细

胞,BAKsup-/sup/BAXsup-/supCHO-K1细胞可以在长达8天的批次培养

条件下,维持着至少达83%以上的活率,而CHO-K1细胞在第4天的活率不足82%,

在之后的2天培养时间内,活率持续下降到72%左右水平;这显示出了

BAKsup-/sup/BAXsup-/supCHO-K1更耐受凋亡并能维持更长时间稳定

培养的特点。

通过新技术的应用和共转染方法的改进,避免了经典方法中繁琐的敲除验证,

以及再次敲除再次验证的实验步骤,提升了敲除目标基因的成功率,达到了构建

具有抗凋亡遗传表型和功能实现的BAKsup-/sup/BAXsup-/supCHO-K1

细胞的目的,具备了作为本文后续研究中的起始出发细胞的工作要求。（2）以

BAKsup-/sup/BAXsup-/supCHO-K1细胞株为研究材料,组合应用了慢病

毒示踪报告基因技术和染色体步移技术,通过对相关方法的实验适应性改进,寻

找到6个绿色荧光标签稳定整合的BAKsup-/sup/BAXsup-/supCHO-K1

细胞基因组内位点。

DNA序列测序明确了整合位点的序列（NWsub0/su1第691045

碱基处,NWsub0/su1第6874389碱基

处,NWsub0/su1第1