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一有助于增强免疫力检验方法

1.实验动物

推荐用近交系小鼠，18－22g，单一性别，每组10－15只。

2.剂量分组及受试样品给予时间

实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。

受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。免疫模型动物实验时间可适当延长。

3.实验方法

3.1ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验

可任选下列方法之一

3.1.1MTT法

3.1.1.1原理

当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞发生增殖反应，活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解酶可将MTT（一种淡黄色的唑氮盐）分解为兰紫色结晶，其光密度值能反映细胞的增殖情况。

3.1.1.2仪器和材料

RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、Hanks液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）

纱布或200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。

3.1.1.3实验步骤

3.1.1.3.1试剂配制

完全培养液RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL），链霉素（100μg/L）及5×10－5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0－7.2，即完全培养液。

ConA液用双蒸水配制成100μg/mL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20℃)保存。

无菌Hanks液用前以3.5%的无菌NaHCO3调pH至7.2－7.4。

MTT液将5mgMTT溶于1mLpH7.2的PBS中，现配现用。

酸性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4mL1mol/L的HCl，临用前配制。

3.1.1.3.2脾细胞悬液制备

无菌取脾，置于盛有适量无菌Hanks液平皿中，用镊子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛

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网过滤，或用4层纱布将脾磨碎，用Hanks液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/mL。

3.1.1.3.3淋巴细胞增殖反应

将每一份脾细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加75μLConA液（相当于7.5μg/mL），另一孔作为对照，置5%CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT（5mg/mL）50μL/孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，721分光光度计上在波长570nm测定OD值。

3.1.1.4数据处理及结果判定

一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值F0.05，结论：各组均数间差异无显著性；F值≥F0.05，P≤0.05，用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。

用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。

3.1.1.5注意事项

本实验中ConA的浓度很重要，过低不能刺激足够的细胞增殖，过高会抑制细胞增殖，不同批号的ConA在实验前要进行预试，以找到最佳浓度。

3.1.2同位素掺入法

3.1.2.1原理

T淋巴细胞在有丝分裂原PHA、ConA等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入3H－胸腺嘧啶核苷（3H-TdR），则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度