实时荧光定量PCR.docx

实时荧光定量PCR

目前实时荧光定量PCR已得到广泛应用，如：扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等......荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBRGreenI的非特异性方法和Taqman水解探针的特异性方法

SYBRGreenI的非特异性方法(试剂盒：LightCycler480SYBRGreenIMaster）

SYBRGreenI是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的染料。在游离状态下，SYBRGreenI发出微弱的荧光，但一旦与双链DNA结合后，荧光大大增强。因此，SYBRGreenI的荧光信号强度与双链DNA的数量相关，可以根据荧光信号检测出PCR体系存在的双链DNA数量。

一、实验前准备：

实验试剂及耗材：

试剂：特异性PCR引物，新鲜提取备用的总RNA

试剂盒:TranscriptorFirstStrandcDNASynthesisKit、LightCycler480SYBRGreenIMaster

1号管包含：

热启动TaqDNAPolymerase、反应缓冲液、dNTPmix、SYBRGreenI染料、MgCI2

仪器及耗材：

罗氏LightCycler480全自动实时定量PCR仪以及配套使用的48或96孔板；ThermoScientificArktikPCR仪、F1单道移液器、冰盒、QSP盒装吸头等

正式实验开始前，冰上解冻各个试剂【注意：SYBRGreenIMaster需要避光放置】

二、反转录

实验操作时注意：所有RNA相关的操作均需要佩戴手套，防止RNase污染。严格按照试剂盒使用说明进行相关操作。

按照体系配方在冰上的Rnasefree的灭菌PCR管中配置Templateprimermix，总体系13ul。本实验是联合使用anchoredoligodT引物和随机六聚体引物进行的反转录。

(1)配制NTC对照：（总13ul）

水——10ul

oligodT引物——1ul

随机六聚体引物——2ul

混匀

（2）配制1、2、3、4号管：（总13ul）

总RNA（s1、s2、s3、s4）——1ul

oligodT引物——1ul

随机六聚体引物——2ul

水——9ul

混匀

【Note：可将总RNA的模板量适当调整至10ng—5ug，mRNA调整至1—100ng。若RNA样品浓度较低，则可加入10ug/ml的MS2RNA来稳定模板RNA】

（3）将配好的反应mix在PCR仪中65℃变性10min，可有效减少RNA的二级结构。加热后，迅速置于冰上制冷，放置5min

（4）在反应Templateprimermix中分别加入以下试剂：

配制总mix（除了RNA模板和引物）

5X反转录酶buffer——24ul（4ulX6管）

dNTPmix——12ul（2ulX6管）

40U/ulRNase抑制剂——3ul（0.5ulX6管）

20U/ul反转录酶——3ul（0.5ulX6管）

mix总体积——42ul（7ulX6管）

若样品数量多，先配制反应mix再分装到各个反应管，小心吹打混匀，切勿涡旋震荡。混匀后于微型离心机上离心，使样品和离心管落至管底。

将离心管放置PCR仪中，根据使用的引物和目标RNA的长度进行程序设置：

25℃10min

55℃30min

85℃5min

最后置于冰上停止反应。

此反应产物可于2℃—8℃存放1—2h，或在﹣15℃至﹣25℃下存放更长时间。cDNA产物无需进行纯化即可用于后续的PCR反应。20ul的PCR反应体系可取2—5ulcDNA反应产物进行扩增。此试剂盒中的反转录酶具有RNaseH活性，可以在cDNA合成之后去除RNA模板，减少其对后续PCR的影响

SYBRGreen反应体系的配制：

使用LightCycler480SYBRGreenIMaster使用进行基础的绝对定量分析。

实验设计：5个标准样品（包含1个空白对照）

5个反转录样品（包含1个NTC对照【NegativeTemplateControl缩写】）

由于样本数较多，如下配置：

不含模板的总体系（594ul）—分装为10管（每管55ul）—每管加入各自的模板（6ul）—每个样分装为3个复管（每管20ul）

按照体系配方配制：

2xMastermix（绿色盖）——330ul（10ulX33）

10xPrimermix?——66ul（2ulX33）

PCR级别水（无色盖）——198ul（6ulX33）

总体积——594ul

用移液枪轻柔吹打混匀，然后分装为10管，每管55ul。

标准对照组:在各个管中分别加入各个样品对应的调整好浓