植物总DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测ppt课件.pptxVIP

植物总DNA的提取

及琼脂糖凝胶电泳检测

植物基因组DNA的提取

琼脂糖凝胶电泳检测

脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)

与蛋白质结合在一起以核蛋白（DNP）的形式存在。在制备核酸时通常破坏细胞壁及细胞膜来使核蛋白释放出来。

植物总DNA包括细胞核DNA和细胞核外DNA,前者存在于细胞核内，后者存在于细胞质中有半自主性复制活性的细胞器内，例如线粒体DNA(mtDNA)和叶绿体DNA(ctDNA)。

背景知识

核酸的存在形式

DNA为白色类似石棉样的纤维状物，RNA的纯品呈白色粉末或结晶。

DNA、RNA和核苷酸都是极性化合物，一般都溶于水，不溶于乙醇、氯仿等有机溶剂，它们的钠盐比游离酸易溶于水。

在酸性溶液中，核酸易水解，中性或弱碱性溶液中较稳定。

核酸的理化性质

细胞破碎抽提去蛋白质沉淀核酸

基本过程

①机械方法：超声波处理法、研磨法、匀浆法；

②化学试剂法：用SDS处理细胞；

③酶解法：加入溶菌酶，破坏细胞壁。

细胞破碎

实验材料

新鲜蔬菜叶片(去叶脉)

试剂

2×CTAB抽提液

TE缓冲液(pH=8.0)

氯仿：异戊醇(24:1)

材料与试剂

①离心机

②水浴锅

③研钵

④微量移液器

仪器用具

移液器－量程的选择

1．取2g清洗凉干的新鲜叶片于研钵中，加1/3药匙石英砂和4mL2倍的CTAB提取液，迅速研磨。

2．将1mL研磨液转入1.5mL离心管中，置于65℃水浴中保温20min，其间颠倒混匀2－3次。破碎细胞

3.12000r/min离心5min，取上清液700μL转到另一离心管中。加入等体积氯仿：异戊醇（24:1）混合液，充分颠倒混匀。12000r/min，离心5min。抽提去蛋白

4．将上清液移入新的1.5mL离心管内，加600µL异丙醇。颠倒混匀，可见DNA絮状沉淀。沉淀核酸

5．12000r/min，离心1min，倒掉上清液，将离心管倒置干燥。将沉淀回溶于20µLTE缓冲液待测。

操作步骤

1)选取新鲜材料，研磨迅速彻底，研磨好的材料应与CTAB抽提液充分混匀；

2)若提取产物有颜色，可能是材料中含有较多的多酚类物质，添加巯基乙醇（2－5％），尽可能选取幼嫩的材料；

3）为了获得具有生物活性的天然核酸，在分离制备过程中必须采用温和的条件，避免过酸过碱、剧烈地搅拌，防止热变性，同时还要避免核酸降解酶类的降解。

注意事项

DNA分子在高于等电点的PH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。在一定电场强度下，DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数成反比。

电泳原理

琼脂糖是一种线性多糖聚合物。

浓度越高，孔隙越小，其分辨能力就越强。

琼脂糖浓度(%)

线型DNA分子的分离范围(Kb)

0.3

5～60

0.6

1～20

0.7

0.8～10

0.9

0.5～7

1.2

0.9～6

1.5

0.2～3

12.0

0.1～2

仪器和试剂

仪器

电泳仪

电泳槽

灌胶模具等

Tris-硼酸（TBE）

Tris-乙酸（TAE）

Tris-磷酸（TPE）

常用电泳缓冲液

电泳指示剂溴酚兰在碱性液体中呈紫兰色，一般与蔗糖、甘油或聚蔗糖400组成上样缓冲液。

作用：

①增加样品比重，以确保DNA均匀沉入加样孔内。

②形成肉眼可见的指示带，预测核酸电泳的速度和位置。

③使样品呈色，使加样操作更方便。

上样缓冲液

溴化乙锭（EB）

是一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光。其荧光强度与DNA的含量成正比。据此可粗略估计样品DNA浓度。

琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng。

核酸染色剂

注意事项：

EB是致癌物质，切勿用手接触，更不要污染环境。

DNA分子量标准

不同种类DNAMarker

1.凝胶制备制备0.8%琼脂糖凝胶。称取适量琼脂糖加入20mL0.5×TBE，加热至琼脂糖全部熔化，冷却至50-60℃时，加入EB至终浓度0.5µg/mL。缓慢倒入胶板，待胶凝固后拔出梳子。

2.加样取10µlDNA样液与2µl上样buffer混匀，用微量移液器小心加入样品槽。

3.电泳接通电源，切记靠近加样孔的一端为负，电压为1~5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）,待溴酚兰移动到一定位置，停止电泳。

4.观察拍照

四、操作步骤

1.结合原理，简述CTAB法分离提取植物总DNA的基本过程。

2.为了获得高质量的植物总DNA，在分离提取过程中应