DB12T 841-2018 转基因植物及其产品成分定量检测技术规范微流滴数字PCR法　　.docxVIP

ICS65.020.20B04

DB12

天津市地方标准

DB12/T841—2018

转基因植物及其产品成分定量检测技术规范微流滴数字PCR法

Technicalguidelinesforquantitativedetectionofgeneticallymodifiedplantsandderivedproducts—DropletdigitalPCRmethod

2018-11-07发布2018-12-01实施

天津市市场和质量监督管理委员会发布

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DB12/T841—2018

前言

本标准按照GB/T1.1—2009给出的规则起草。本标准由天津市农村工作委员会提出并归口。

本标准起草单位：天津市农业质量标准与检测技术研究所、中国农业科学院生物技术研究所、天津市东丽区产品质量监督检验所。

本标准主要起草人：兰青阔、兰璞、李亮、赵新、沈晓玲、王成、宛煜嵩、陈锐、黄凤军、李文、李益歌。

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DB12/T841—2018

转基因植物及其产品成分定量检测技术规范微流滴数字PCR法

1范围

本标准规定了转基因植物及其产品微流滴数字PCR检测方法的建立与确认的总体要求。本标准适用于转基因植物及其产品成分检测的微流滴数字PCR检测方法的建立与确认。

2术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

2.1

微流滴数字PCRdropletdigitalPCR

将DNA模板、引物/荧光探针、耐热DNA聚合酶及其缓冲液等PCR反应体系充分混匀后，通过乳化的方式分配至体积相同且相互物理隔离的油包水微流滴中。将形成的微流滴进行PCR扩增，对扩增后的微流滴进行荧光信号采集，通过阳性率和泊松分布计算获得样品中靶序列拷贝数或拷贝数浓度。

2.2

靶序列targetsequence

在PCR检测方法中，用作检测靶标的特异性DNA序列。

2.3

特异性specificity

实时荧光定量PCR的引物和探针对样品中靶标片段精准识别的能力。

2.4

定量限limitofquantification(LOQ)

在可接受的正确度和精密度水平上，样品中被定量检出的最低DNA模板含量或浓度。

2.5

正确度trueness

多次测试的均值与采纳的标准值之间的接近程度。

2.6

方法确认validationofmethod

通过提供明确的实验证据，证明所使用的检测方法能够充分满足测试目标的需求。

3实验室资质

进行转基因植物数字PCR检测方法制定的实验室，应满足以下要求：

——具备资质的转基因生物安全机构，从事过转基因植物成分定量测量工作，参加过权威部门组织的转基因植物定量测量能力验证或计量比对，并且测量结果在可控范围内；

——具备承担转基因生物安全检测工作所需的仪器设备和环境设施；

——转基因植物数字PCR检测方法研制人员应具备转基因生物安全检测工作相关业务知识。

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DB12/T841—2018

4技术要求

4.1方法的建立

4.1.1检测引物和探针的设计与筛选

依据靶序列设计引物和探针，通过实验对其进行比较分析，筛选出适合的引物和探针组合，确保其对靶序列具有严格的特异性和符合要求的检测灵敏度。

4.1.2PCR反应体系和反应程序优化

通过试验确定适合的反应体系(模板量、引物、探针浓度等)及反应程序(退火温度、循环数等),能有效区分微反应体系的阳性信号和阴性信号。采用多重PCR检测方法的，应提供与单重PCR检测方法的对比结果。

4.1.3方法特异性测试

通过试验验证检测方法的特异性；特异性测试样品至少应包括三类：——含有靶序列的转基因植物材料；

——不含有靶序列的转基因植物材料；——不含靶序列的非转基因植物材料。

4.1.4方法灵敏度测试

依据技术平台，选择合理的靶序列拷贝数浓度测试范围，确定方法的线性动态范围和定量限。灵敏度测试浓度点数不少于5个，至少3次重复，每次试验至少设置3个平行。

4.1.5方法适用性测试

选择合适的加工品类型，测试方法的适用性。

4.2实验室内方法验证

4.2.1线性度

微流滴数字PCR方法的线性度以线性回归曲线的决定系数R2表示，均值应≥0.98。

4.2.2精密度

线性动态范围内的精密度用重复性相对标准偏差RSDr表示，应≤25%。

4.2.3正确度

在整个线性动态范围内，多次测试的均值与采纳的标准值之间的接近程度，且偏差不超过标准值的25%。

4.2.4定量限

线性动态范围内，符合精密度条件的最低拷贝数浓度。

4.2.5再现性