克隆文库的分析.ppt

RDP归类输入序列RDP分类?置信度调至95%?此处为具体分类，但需要进一步的看归类的置信度RDP分类重新开始点此处带有置信度的分类系统发育树的构建：目的是用于对克隆序列进行进一步的精确地归类。01注意事项：1）克隆的序列不能有反向序列（主要是测序时产生的）2）标准菌株的选择（尽量选择具有具体种属信息的序列，或者相似环境下的序列）3）对树要多计算几次来评估树的稳定性。02系统发育树的构建如何判断序列是反向序列：第一种：在BLAST序列比对时对自己的序列与网上的序列进行比较看你们的序列是否是从小到大排列对应的（也就是说你的序列是8F应该对应的是别人的8F或者小的）第二种：预先将所有的序列构建一次系统发育树，如果有出现进化距离特别远的序列，该序列为反向序列的可能非常大。系统发育树构建此处序列为反向序列反向序列修正系统发育树构建系统发育树构建使用软件MEGA4.0。具体方法参考《进化树制作过程》。克隆文库分析leolvcxm99内容文库评价序列的拼接载体去除嵌合子去除BLAST比对RDP归类系统发育树构建序列提交文库评价文库评价：主要是指对构建的克隆文库中酶切的克隆子个数是否能够代表整个环境绝大多数微生物类群，以及如何科学性的进行选择酶切克隆子数。单文库：每次以100个克隆为基数进行酶切，切完后对库中只出现一次的条带进行统计，简单计算其所占比重，覆盖率达到80%左右即可。多文库：每次以50个克隆为基数进行酶切，分别进行计算覆盖率，其中任何一个达到60%左右即可。酶切克隆子个数选择策略例.单个文库可以尽量的选择到曲线变的平滑阶段，例.多个文库对比性的去取，其中任何一个样品若出现有变得缓慢即可停止。采用EstimateS8.0软件进行稀有度分析。()0102软件使用如下：稀有度曲线分析数据录入1文库名称2格式行：此行全部为写为13格式行：此行全部为写为-1，表示结束4OTUs数：首行为总个数酶切的克隆个数：首行写总个数，次行从1开始按自然数排列软件操作结果稀有度曲线制作以individuals为横坐标，Sobs为纵坐标在Excel中作曲线。稀有度曲线序列拼接：是指测序反应将一个长度大于1000bp的序列分别于两端进行测序所得的两个序列进行拼接在一起。1使用软件contig2序列拼接软件操作测序返回的结果ab1格式的文件是指带有测序峰图的序列文件，序列拼接首选该文件。由于测序常常使用的是载体上的序列，因此需要将所测序的结果进行去载体。载体的去除，使用NCBI数据库中的sequenceanalysis中的vecscreen.0102载体去除载体去除嵌合子剔除运用CHECK_CHIMERA(http://wdcm.nig.ac.jp/RDP/cgis/chimera)对测序所得的细菌16SrRNA基因序列进行嵌合子序列的检查和剔除BLAST序列比对登录NCBI主页（）然后选择选择BLASTBLAST序列比对输入菌株编号输入序列比对结果比对结果处理这样做的目的是能够快速，方便的对标准菌株进行选择。对比对得到的结果进行处理：建立一个word文档将相似性较高的序列复制粘贴进文档。如图总体标准：尽量选择具有相似性高的纯培养菌。02标准菌株的选择：根据自己未来所要写的文章的内容的论据来进行选择。由于克隆文库所得的序列大部分为不可培养类群，因而标准菌株的选择要选取与你环境相似，并且在分类上具有较为详细的分类的菌株。01标准菌株的选择克隆文库所得序列往往是一些不可培养类群，因而很难确定其具体分类地位，因此选择使用RDPClassifer在线归类系统。（）RDP归类RDP归类