2025年高考生物二轮复习大单元8生物技术与工程层级三.pptxVIP

;;【例1】重叠延伸PCR技术是一项重要的基因定点突变技术,其主要设计思路是用具有互补配对片段的引物(如图中的引物2和3,突起处代表与模板链不能互补的突变位点),分别进行PCR,获得有重叠链的两种DNA片段,再在随后的扩增反应中通过重叠链的延伸获得想要的目的基因。水蛭素是一种蛋白质,可用于预防和治疗血栓。某科研团队运用重叠延伸PCR技术在水蛭素基因中的特定位点引入特定突变,使水蛭素第47位的天冬酰胺(密码子为AAC、AAU)替换为赖氨酸(密码子为AAA、AAG),从而提高水蛭素的抗凝血活性。原理如图所示。;(1)若拟突变位点的碱基对为A—T,则需要让其突变为才能达到目的。引物2的突变位点(突起处)应设计为(假设引物为单链DNA)。?;(2)在第一阶段获得两种具有重叠片段DNA的过程中,引物1、引物2组成的反应系统和引物3、引物4组成的反应系统中均进行一次复制,共产生____种DNA分子。该阶段必须将引物1、2和引物3、4置于不同反应系统中,这是因为_________________________________________________________

。?

(3)利用重叠延伸PCR技术还可以将两个不同来源的DNA片段拼接起来。有人想利用该技术把基因M和N拼接在一起,设计基因M的引物M1、M2,基因N的引物N1、N2。在设计这4种引物时,特别要注意的问题是

_____________________________________________________________。?;;(2)构建融合基因,重叠延伸PCR还可以用于两个或两个以上异源基因DNA片段的拼接。引物上含

有末端互补序列,通过PCR产生的两个DNA片段可通过引物延伸进行剪接和扩增,从而获得重组体,与定点突变不同的是待融合基因的PCR产物来自两个不同的基因,通过引物在两种PCR产物中产生互相重叠的链而获得融合基因。;2.反向PCR技术

反向PCR技术是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段,对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。;【例2】反向PCR是一种通过已知序列设计引物对未知序列进行扩增的技术,其过程如下图所示。下列叙述正确的是();A.应选择引物1和引物4进行PCR扩增

B.设计的引物中G、C碱基含量越高,复性的温度越低

C.PCR产物是包含所有已知序列和未???序列的环状DNA分子

D.整个过程需用到限制酶、DNA连接酶、耐高温的DNA聚合酶及逆转录酶

答案A;;3.不对称PCR

正常的PCR反应需要一对相对配置的引物同时扩增的两条模板链。如果只加入一条引物,那么将会只扩增一条模板链。像这种加入一条引物扩增的PCR反应叫作不对称PCR。;【例3】(2024·山东临沂一模节选)研究人员常用DNA分子杂交技术检测目的基因是否整合到受体细胞的染色体DNA上,检测时用标记的目的基因单链片段作为探针。不对称PCR能够大量制备单链DNA片段,其基本原理是采用不等量的一对引物,经若干次循环后,低浓度的引物(限制性引物)被消耗尽,以后的循环只产生高浓度引物(非限制性引物)的延伸产物,结果获得大量单链DNA(ss-DNA)。若反应体系中原有100个模板DNA,最初10个循环后限制性引物耗尽,再进行20个循环,理论上可制备ss-DNA(用科学计数法表示),在这30个循环中ss-DNA的产生量主要受的影响。?;;4.实时荧光定量RT-PCR

实时荧光定量RT-PCR主要是通过荧光PCR连续监测荧光信号出现的先后顺序以及信号强弱的变化,实时分析目的基因的初始量,该技术的发明实现了PCR从定性到定量的飞跃。RT表示逆转录。在RT-PCR中,通过逆转录酶将RNA转化为cDNA,然后通过聚合酶链式反应扩增cDNA。;【例4】“实时荧光定量RT-PCR”是一种用于实时扩增和检测特定DNA或RNA序列的分子生物学技术。TaqMan探针是实时荧光定量RT-PCR技术中一种常用探针(如图1),其5端连接荧光基团(R),3端连接淬灭剂(Q)。当探针完整时,R发出的荧光信号被Q吸收而不发荧光。在PCR扩增过程中,当Taq酶遇到探针时会使探针水解而释放出游离的R和Q,R发出的荧光信号被相应仪器检测到,荧光信号的累积与PCR产物数量完全同步(如图2)。请据图回答下列问题。;图2;(1)这种分子层面的荧光RT-PCR检测具有特异性和灵敏性都很高的特点,主要与试剂盒中的、有关。?

(2)在实时荧光定量RT-PCR过程中,通过荧光强度的变化监测产生量的