固定化-淀粉酶及活性测定要点.pdf

实验六固定化α-淀粉酶及活性测定

一、实验目的：学会交联法制备固定化酶的操作技术

二、实验原理：制备固定化酶的方法很多，利用双功能试剂或多功能试剂在酶分

子间，酶分子与惰性蛋白间，或酶分子与载体间进行交联反应，以共价键制备固

定化酶的方法称为交联法，本实验即采用这种方法。交联剂为戊二醛，载体为甲

壳素。

三、实验器材：

1．恒温水浴锅

2．恒温振摇仪

四、实验试剂

1.5%戊二醛

2.甲壳素

3.碘原液：称取碘1.1g。碘化钾2.2g，置于小烧杯中，加10ml蒸馏水使之溶

解，然后转入容量瓶中。再加少量的蒸馏水洗涤烧杯数次，洗涤液均转入容量瓶

中，最后定容至50ml。摇均后放于棕色试管中备用。

4.比色稀碘液：取碘原液2ml，加碘化钾20g，再用蒸馏水定容至5000ml。

5.2%淀粉溶液：称取2g可溶淀粉，放入小烧杯中，加少量蒸馏水做成悬浮液。

然后在搅拌下注入沸腾的蒸馏水中，继续煮沸一分钟，冷却后加蒸馏水定容至

100ml。

6.pH6磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液：称取磷酸二氢钠（Na2HPO4.12H2O）

45.23g,柠檬酸（CHO.HO）8.07g,先在烧杯中使之溶解，然后转入容量瓶中

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定容至1000ml。

7.标准终点色溶液，

A液：精确称取氯化钴（CoCl.6HO）40.2493g和重洛酸钾（KGrO）

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0.4878g，用蒸馏水定容至500ml.

B液:：精确称取络黑T40mg，用蒸馏水定容至100ml.

同时取A液40ml、B液5ml、混合后置于冰箱中待用。混合液在15天内

使用有效。

五、实验操作

1.酶液的制备：

精确称取α-淀粉酶2g，先用少量40℃pH6的磷酸二氢钠——柠檬酸缓冲液

溶解，溶解过程中轻轻用玻璃棒捣研。将上层液小心倾入100ml容量瓶，沉渣

部分再加入少量上述缓冲液，如此反复捣研3—4次。最后，将溶液与残渣全部

移入容量瓶中，用缓冲液先定容摇匀后，通过四层纱布过滤，溶液供测定使用。

2.固定化酶的制备

(1)称取50mg粉末甲壳素，加入5%戊二醛10ml，调节pH=8.5，搅拌均匀后，

于25℃，恒温振摇1小时。取出后，倾去戊二醛，然后以蒸馏水洗涤，倾去清

夜，以除去多余的交联剂。

(2)取前面制备的酶液10ml，与上述处理的甲壳素混合均匀，25℃，恒温振摇1

小时，然后4℃冰箱放置过夜。

(3)取出后，4000rpm离心分离，倾去清液，蒸馏水洗涤，可得固定化酶

3.固定化α-淀粉酶活力测定及活力回收率的计算

（1）首先用吸管取1ml的标准终点色溶液，加至白瓷板的空穴内，作为终点参

照的标准。

（2）固定前总酶活力测定：取20ml2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠

——柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将试管置于60℃水浴5分钟。然后加

入前面制备的酶液0.5ml。摇匀后，立即用秒表记录时间。此后，每经一段时间，

用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜色反应由

紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达终点时的

时间。

（3）固定化酶活力测定：取20ml2%的可溶淀粉液与5mLpH6的磷酸氢二钠—

—柠檬酸缓冲液，加入一支大试管中。将试管置于60℃水浴5分钟。然后加入

前面制备的固定化酶。摇匀后，立即用秒表记录时间。此后，不断振摇，每经一

段时间，用吸管吸出0.2ml反应液，加入预先盛入稀碘液的白瓷板中。当穴内颜

色反应由紫色逐渐变为红棕色并与标准色相同时，即为反应终点，记录反应到达

终点时的时间。

（4）酶活力计算：以60℃、pH6的条件下，每小时水解1g淀粉的酶量为一个

活力单位。