《化妆品原料眼刺激试验-胶原蛋白凝胶》.docxVIP

DB4403/T60—2020

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ICS号

中国标准文献分类号

T/XXXXXX—20XX

化妆品原料眼刺激试验-胶原蛋白凝胶

Testmethodforeyeirritationofcosmeticingredients–

collagenhydrogel

20XX-XX-XX发布

20XX-XX-XX实施

深圳市质量检验协会???发布

团体标准

T/XXXXXX—20XX

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目??次

TOC\h\z\t前言、引言标题,1,参考文献、索引标题,1,章标题,1,参考文献,1,附录标识,1前言 II

引言 III

1范围 1

2规范性引用文件 1

3术语和定义 1

4试验原理 1

5试验材料与试剂 1

6试验步骤 2

7结果计算与判定 3

8结果解释 4

附录A（资料性）TEER测定系统 4

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前??言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由深圳市质量检验协会提出并归口。

本文件起草单位：深圳市药品检验研究院、上海市食品药品检验研究院、湖北省药品监督检验研究院、中国检验检疫科学研究院、湖北省药品监督管理局药品审评检查中心。

本文件主要起草人：王进美、王平、秦美蓉、陈宁、王晓炜、郑霖、姜睿琪、刘楚珩、巩鑫超、冼静雯、邓思思、黄泽愉、李俊鹏、黄后双、谢天柱、孙裕彬、陈润桦、吴熙、张真、冯震、黄坚、李睿、吕晓君、史梦婷、何开勇、代汉慧、陈云霞、于红梅。

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引??言

随着欧盟化学品监管REACH法规的颁布以及“禁止经过动物测试的化妆品及原料上市”规定的实施，我国化妆品原料行业正面临着欧盟技术和安全标准的贸易壁垒。本方法可应用在化妆品原料（尤其是出口产品）的眼刺激性评价试验领域。

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化妆品原料眼刺激试验-胶原蛋白凝胶

范围

本文件规定了化妆品原料眼刺激试验-胶原蛋白凝胶的基本原则、要求和方法。

本文件适用于化妆品原料安全性毒理学检测。

规范性引用文件

本文件无规范性引用文件。

术语和定义

以及下列术语和定义适用于本文件。

眼睛刺激性eyeirritation

眼球表面接触受试物后所产生的可逆性炎性变化。

[来源：化妆品安全技术规范2015年版]

眼睛腐蚀性eyecorrosion

眼球表面接触受试物后引起的不可逆性组织损伤。

[来源：化妆品安全技术规范2015年版]

跨膜电阻transepithelialelectricalresistance，TEER

跨细胞层的电阻，表征细胞层的完整性，单位Ω·cm2。

试验原理

将人角膜上皮细胞接种在胶原蛋白凝胶上构建人角膜上皮模型，通过检测暴露于受试物后人角膜上皮模型的跨膜电阻随时间的变化来判断角膜上皮屏障的破坏程度，进而预测和评价受试物的眼刺激性/腐蚀性检测。

试验材料与试剂

细胞株

采用人角膜上皮细胞HCE-T，该细胞为贴壁生长。要求来源清晰，代数明确（＜25代）。

培养基

采用DMEM/F121:1培养基，加入5%FBS、5μg/mL人重组胰岛素、10ng/mL人重组表皮生长因子、0.5%DMSO、100UI/mL青霉素和100μg/mL链霉素。

受试物的配制

受试物溶液或悬浮液由培养基配制，浓度为2.5%（w/v）。优先选择手动混匀。若受试物不能溶解，则应依次选择下述办法促进溶解：

1.涡旋，时间不超过1分钟；

2.超声，时间不超过20分钟；

3.加热，最高温度不超过70℃。

当受试物通过以上方法仍不能溶解或形成均匀悬浮液，则应涡旋混匀后立即使用。受试物应在使用前新鲜配制，否则必须证实储存不影响其稳定性。

对照溶液的配制

阳性对照溶液：称取250mg苯扎氯铵，溶解于10mL培养基中，可以超声加速溶解，现用现配。

参考品对照溶液：称取250mg乙醇，溶解于10mL培养基中，现用现配。

阴性对照溶液：称取250mg生理盐水（0.9%氯化钠溶液），溶解于10mL培养基中，现用现配。

试验步骤

角膜上皮模型的制备

胶原蛋白凝胶膜的准备：从4℃冰箱取出胶原蛋白干凝胶膜小室，恢复至室温，向小室的外侧和内侧分别加入1.5mL和0.5mL培养基，平衡10分钟，即得到胶原蛋白凝胶膜。

角膜上皮模型的构建：将胶原蛋白凝胶膜小室外侧的培养基更换为1.5mL新鲜培养基，吸走小室内侧的培养基，向小室内加入0.5mL密度为1.2×105细胞/mL的