Western-Blot的基本原理.课件.pptVIP

过硫酸铵（APS）四甲基乙二胺（TEMED）*背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA(DNA－DNA)杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southernblot。RNA印迹技术正好与DNA相对应，对RNA的印迹分析称为Northernblot。HarryTowbin在1979年提出对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Westernblot，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Easternblot。WesternBlot的基本原理在电场的作用下，将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质混合物从凝胶转移至固相支持膜上，再利用某种蛋白（目的蛋白，如GAPDH）的特异性抗体来对其进行鉴定，可进行定量分析。WesternBlot的一般流程蛋白样品的制备SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳转膜封闭一抗杂交二抗杂交底物显色蛋白样品制备实验原理：利用Triton-100等去垢剂破坏细胞的膜结构，细胞内含物（主要是蛋白质）释放出来，常用RIPAbuffer等裂解液，在此裂解条件下DNA一般形成沉淀，蛋白质溶于上清中。注意事项：全部操作需在冰上进行；需要加蛋白酶抑制剂；123456考马斯亮蓝溶液3mL3mL3mL3mL3mL3mL0.5mg/mLBSA0μL20μL40μL60μL80μL100μLddH2O100μL80μL60μL40μL20μL0μL蛋白定量标准曲线原理：考马斯亮蓝G250与蛋白质分子结合形成复合物，在595nm处有最大光吸收，其值在一定范围内（0-50μg）与蛋白浓度成正比。优点：简单易行；缺点：各种干扰因素较大打开分光光度计，预热30分钟，将波长修改为595nm用干净的比色皿，以1#管调零，作为参比溶液，以此测定2#—6#管，每管取均值测量结束后以ddH2O洗比色杯1次，95%乙醇洗3次，晾干待用依据测量结果绘制考马斯亮蓝曲线。实验步骤：1、加入500μL的RIPAbuffer，用注射器反复吹吸，冰上孵育30分钟；2、10,000g，4℃离心10分钟，转移上清（300μL）至新管；3、按照每管3mL考马斯亮蓝染液，2μL样品，98μLddH2O配制液体；对照为：3mL考马斯亮蓝染液，2μLRIPA，98μLddH2O配制液体；4、用同样方法在可见光分光光度计上测量OD595值；5、根据测量结果以及标准曲线计算出样品中的蛋白含量；6、按总体积25μL，终浓度为1*LoadingBuffer，还有25μg蛋白混合样品，不足体积用1*PBS补足7、短暂离心，煮沸5min，短暂离心，上样电泳。SDS（SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳）蛋白质电泳的行为：带电性和分子量原理：SDS是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链.当SDS与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性氨基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用，由于SDS带强负价,使蛋白质原先的带电价微不足道,所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素。浓缩胶（4%）PH6.8分离胶（5-15%）PH8.8分离胶浓度（％）线性分离范围（kD)1512-431016-687.536-945.057-212PH8.3分离胶：1.5MTris-HClpH8.8浓缩胶：0.5MThis-HCLpH6.8胶浓度ddH2O凝胶储备液（mL）Gelbuffer(mL)10%V/VSDS(mL)10%APS(μL)TEMED(μL)4%(浓缩胶)6.11.32.50.1502010%（分离胶）4.13.32.50.15010湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45分钟或过夜，需冰盒散热。步骤较为繁琐。蛋白质分子量较大（100kD）建议用湿转。转膜半干法：将凝胶和固相基质像三明治一样加在用缓冲液浸润的滤纸之间。与湿转相比，半干法又快（15-45分钟）又方便。可以同时高效转移大小不同的蛋白。小分子量的蛋白半干转效果比较好。NC膜尼龙膜PVDF膜灵敏度和分辨率高高高背景低较高低结合能力80-110μg/cm2400μg/cm2125-200μg/cm2(适合于SDS存在下与蛋白质的结合）材料质地干的NC