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(完整word)微生物常规鉴定技术

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(完整word)微生物常规鉴定技术

微生物常规鉴定技术

一.形态结构和培养特性观察

1。微生物的形态结构观察主要是通过染色,在显微镜下对其形状、大小、排列方式、细胞结构（包括细胞壁、细胞膜、细胞核、鞭毛、芽孢等）及染色特性进行观察，直观地了解细菌在形态结构上特性，根据不同微生物在形态结构上的不同达到区别、鉴定微生物的目的。

2.细菌细胞在固体培养基表面形成的细胞群体叫菌落（colony）。不同微生物在某种培养基中生长繁殖，所形成的菌落特征有很大差异，而同一种的细菌在一定条件下，培养特征却有一定稳定性。，以此可以对不同微生物加以区别鉴定。因此,微生物培养特性的观察也是微生物检验鉴别中的一项重要内容。

2。1细菌的培养特征包括以下内容：在固体培养基上，观察菌落大小、形态、颜色（色素是水溶性还是脂溶性）、光泽度、透明度、质地、隆起形状、边缘特征及迁移性等。在液体培养中的表面生长情况（菌膜、环）混浊度及沉淀等。半固体培养基穿刺接种观察运动、扩散情况.

2。2霉菌酵母菌的培养特征:大多数酵母菌没有丝状体，在固体培养基上形成的菌落和细菌的很相似，只是比细菌菌落大且厚。液体培养也和细菌相似，有均匀生长、沉淀或在液面形成菌膜。霉菌有分支的丝状体，菌丝粗长,在条件适宜的培养基里，菌丝无限伸长沿培养基表面蔓延.霉菌的基内菌丝、气生菌丝和孢子丝都常带有不同颜色，因而菌落边缘和中心,正面和背面颜色常常不同,如青霉菌：孢子青绿色，气生菌丝无色，基内菌丝褐色。霉菌在固体培养表面形成絮状、绒毛状和蜘蛛网状菌落.

二、生理生化试验

微生物生化反应是指用化学反应来测定微生物的代谢产物，生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。

微生物检验中常用的生化反应有：

1、尿素酶（Urease）试验

有些细菌能产生尿素酶，将尿素分解、产生2个分子的氨，使培养基变为碱性，酚红呈粉红色。尿素酶不是诱导酶，因为不论底物尿素是否存在，细菌均能合成此酶。其活性最适pH为7.0。

试验方法：挑取18～24h待试菌培养物大量接种于液体培养基管中，摇均，于36±1℃培养10，60和120min,分别观察结果。或涂布并穿刺接种于琼脂斜面，不要到达底部,留底部作变色对照。培养2,4和24h分别观察结果，如阴性应继续培养至4天，作最终判定，变为粉红色为阳性。

2.氧化酶(Oxidase)试验

氧化酶亦即细胞色素氧化酶，为细胞色素呼吸酶系统的终末呼吸酶，氧化酶先使细胞色素C氧化,然后此氧化型细胞色素C再使对苯二胺氧化，产生颜色反应。

试验方法：在琼脂斜面培养物上或血琼脂平板菌落上滴加试剂1~2滴，阳性者Kovacs氏试剂呈粉红色~深紫色，Ewing氏改进试剂呈蓝色。阴性者无颜色改变。应在数分钟内判定试验结果。

注意事项:

盐酸二甲基对苯撑二胺溶液容易氧化,溶液应装在棕色瓶中,并在冰箱内保存,如溶液变为红褐色,即不宜使用。

铁、镍铬丝等金属可催化二甲基对苯撑二胺呈红色反应，若用它来挑取菌苔，会出现假阳性，故必须用白金丝或玻璃棒(或牙签)来挑取菌苔。

在滤纸上滴加试剂，以刚刚打湿滤纸为宜,如滤纸过湿，会防碍空气与菌苔接触,从而延长了反应时间,造成假阴性。

3.过氧化氢酶的测定

过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和氧。

试剂：3－10％过氧化氢(H2O2）

菌种培养：将测试菌种接种于合适的培养基斜面上，适温培养18－24h。

试验方法：取一干净的载波片，在上面滴1滴3－10％的H2O2,挑取1环培养18－24h的菌苔，在H2O2溶液中涂抹,若有气泡(氧气）出现，则为过氧化氢酶阳性，无气泡者为阴性.也可将过氧化氢溶液直接加入斜面上,观察气泡的产生。

注意事项：过氧化氢酶是1种以正铁血红素作为辅基的酶，所以测试菌所生长的培养基不可含有血红素或红血球。

4、甲基红（MethylRed）试验

肠杆菌科各菌属都能发酵葡萄糖,在分解葡萄糖过程中产生丙酮酸，进一步分解中，由于糖代谢的途径不同，可产生乳酸，琥珀酸、醋酸和甲酸等大量酸性产物，可使培养基PH值下降至pH4.5以下，使甲基红指示剂变红。

试验方法:挑取新的待试纯培养物少许，接种于MR－VP生化鉴定管，于36通用培养基，培养于36±1°C或30°C（以30°C较好）3~5天，从第二天起，每日取培养液1ml，加甲基红指示剂1～2滴,阳性呈鲜红色,弱阳性呈淡红色，阴性为黄色。迄至发现阳性或至第5天仍为阴性、即可判定结果.

甲基红为酸性指示剂，pH范围为4。4~6.0,其pK值为5。0.故在pH5。0以下，随酸度而增强黄色，在pH5.0以上，则随碱度而增强黄色，在pH5.0或上下