DB12T 1271-2023 有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法　.docxVIP

ICSCCS

65.080B10

12

天津市地方标准

DB12/T1271—2023

有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法

RapiddetectionofliveEscherichiacoliinorganicfertilizerbyPMA-qPCRmethod

(点击此处添加与国际标准一致性程度的标识)

2023-11-07发布2023-12-08实施

天津市市场监督管理委员会发布

DB12/T1271—2023

I

前言

本文件按照GB/T1.1—2020《标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

本文件由天津市农业农村委员会提出并归口。

本文件起草单位：天津市农业科学院畜牧兽医研究所、农业农村部环境保护科研监测所。

本文件主要起草人：张蕾、田雪力、池晶晶、路超、杨春蕾、韩静、王丽丽、白朋勋。

DB12/T1271—2023

1

有机肥中活性大肠杆菌快速测定PMA-qPCR法

1范围

本文件规定了有机肥中活性大肠杆菌PMA-qPCR测定方法的试剂与引物、主要仪器设备、样品采集、检测步骤和检测结果等技术内容。

本文件适用于有机肥中活性大肠杆菌的检测。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其必威体育精装版版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T19438.1禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法GB19489实验室生物安全通用要求

NY/T525有机肥料

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。3.1

活性大肠杆菌liveEscherichiacoli

在一定条件下可以引起人和多种动物发生胃肠道感染或尿道等多种局部组织器官感染的致病菌。

3.2

暗反应darkreaction

二氧化碳在植物细胞内，经一连串酵素反应，被还原成为葡萄糖的过程。3.3

光反应lightreaction

光合作用中，光能转变成为化学能的过程。

4缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PMA：叠氮溴化丙锭（propidiummonoazide）

PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

qPCR：实时荧光定量PCR（quantitativereal-timePCR）

SYBRGreenI：核酸凝胶染料(SYBRgreennucleicacidgelstains)ROX:参比染料（ROXreferencedye）

5原理

DB12/T1271—2023

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PMA是光敏DNA染料，可与DNA发生不可逆的共价交联反应。PMA无法透过活性细菌完整的细胞膜，但可以进入死亡细菌受损细胞膜，并永久修饰其DNA，阻断DNA的PCR扩增。在强光照射下，游离在溶液中未与核酸交联的剩余PMA可与水分子反应，生成没有活性的羟胺。羟胺不会对后续从活细菌提取的DNA进行修饰，不影响DNA正常扩增。

样品经PMA预处理后再进行DNA提取及PCR扩增，可以克服常规PCR无法区分活性细菌与死亡细菌释放出的游离DNA的缺陷，有效避免PCR检测中的假阳性结果。

6试剂与引物

6.1试剂

6.1.1除另有规定外，试剂均为分析纯或生化试剂。试验用水应符合GB/T6682中二级水的要求。

6.1.2PMA储备液（5μg/μL）：1mgPMA溶于200μL20%的DMSO溶液中，-20℃避光保存。

6.1.3PMA工作液：将PMA储备液以20%DMSO溶液稀释10倍。

6.1.40.01mol/L（pH7.2）PBS：配方见GB/T19438.1附录A。

6.1.595%乙醇。

6.1.6DNA提取试剂盒。

6.1.7SYBRPremixExTaq染料法实时荧光定量试剂盒：内含TaKaRaExTaqHS，dNTPMixture，Mg2+，TliRNaseH，SYBRGreenI。根据qPCR仪型号选用ROX或ROXII校正。

6.1.8qPCR标准品：含有目的基因的克隆质粒，也可采用经纯化后的基因组DNA。

6.2引物

大肠杆菌uidA基因qPCR扩增所用引物见表1。

表1大肠杆菌uidA基因