现代分离提取——层析技术.pptVIP

第四章层析技术Chapter4Chromatography一、引言色层分析法，简称层析法，也称色谱法。一般指待分离液体（流动相，mobilephase)经过一个固态物质（固定相，solidphase）后所发生的组分分布变化。混合物中各组分理化性质的差别（如分子形状和大小），分子极性及分子亲和力等，使它们以不同程度分布在两相中，从而以不同速度相对于固相移动而达到分离。20世纪初开始形成1906年，俄国植物学家M.Tswett将CaCO3装入柱内，让一定量的绿叶石油醚提取液通过CaCO3填充柱，石油醚冲洗，将叶绿素分成许多不同的条带，各色带间是无色的区带。为此也称层析技术为色谱。1931年R.Kuhu等利用层析技术将卵黄中的叶黄素分成黄体素和玉米黄质素。1941年A.J.PMartin和R.L.MSynge用硅胶装柱，经柱层析分离了混合液中的氨基酸。分配系数用K表示：K=溶质在固定相中的浓度/溶质在流动相中的浓度=Cs/Cm由于混合物中各组分的K值的差异性，即可使各组分分离。K值大表示物质在柱中牢固地吸附在固定相中，在固定相中停留时间长，而在流动相中迁移的速度慢，溶质出现在流动相中较晚。相反，K值小，溶质出现在洗脱液中较早。注意在吸附层析中，K为吸附平衡系数在分配层析中，K为分配系数在离子交换层析中，K为交换系数在亲和层析中，K为亲和系数二、层析技术分类1.根据层析原理不同吸附层析分配层析2.按照流动相的相状态不同液相层析法超临界流体层析法气相层析法3.按照驱动流动相动力（压力）的不同低压（〈0.5MPa)常压层析中压（压力为0.5-4.0MPa）高压层析（压力为4.0-40MPa)柱层析（ColumnChromatograph）第二节离子交换层析1.基本原理2.离子交换剂的分类及性质3.离子交换剂与缓冲液的选择4.操作1.基本原理离子交换层析:利用物质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用达到分离纯化的目的，属于吸附层析。离子交换剂是由具有网状结构的高分子聚合物骨架组成。这种不溶性骨架有树脂，纤维素，葡聚糖凝胶，聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等不同种类。这些骨架在交换过程中不发生任何反应。1.基本原理离子交换剂是由基质、电荷基团（或功能基团）和反离子构成。在水中呈不溶解状态，能释放出反离子。反应主要以离子交换方式和吸附作用进行，反应是可逆的。离子交换剂对溶液中各种离子具有不同结合力，结合力大小是由离子交换剂的选择性决定。在网状结构骨架上有许多共价结合的带电基团侧链。阴离子交换剂：带有正电基团，可与带负电的离子相结合阳离子交换剂：带有负电基团，可与带正电的离子相结合通过离子交换层析分离物质的最重要依据是物质的带电荷状态。1.基本原理1.离子价数越高，结合力越大。2.在离子间电荷相同时，则离子的原子序数越高，水合离子半径越小，结合力越大。3.蛋白质等两性离子，与离子交换剂的结合力主要取决于它们的物理化学性质和在特定PH条件下呈现的离子状态。4.PHPI时，可被阴离子交换剂吸附，PHPI时，可被阳离子交换剂吸附。1.平衡阶段：离子交换剂与反离子结合2.吸附阶段：样品与反离子进行交换3.解吸附阶段：用梯度缓冲液洗脱，先洗下弱吸附物质，而后洗下强吸附物质.4.再生阶段：用原始平衡液进行洗涤即可重复使用。2.离子交换剂的分类及性质实用的离子交换剂应满足以下性质：1.有高度的不溶性，即在各种溶剂中进行交换时，交换剂不发生溶解。2.有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换。3.有较多的交换基团。4.有稳定的物理化学性质，在使用过程中，交换剂不能因物理或化学因素的变化而发生分解和变形等现象。3.分类根据电荷基团的性质分为：阳离子交换剂：电荷基团带负电，反离子带正电。阴离子交换剂：引入季胺，叔胺，仲胺和伯胺基团构成。螯合离子交换剂：对金属离子有较强的选择性。1.基本原理2.常用凝胶过滤层析介质3.凝胶过滤层析的用途及优缺点4.凝胶过滤层析的基本操作1.基本原理凝胶过滤层析所用的基质是具有立体网状结构，筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。这种多孔的载体对不同大小，不同形状的分子排阻能力不同，因而可以完全或者部分排阻。某些大分子化合物被排阻于