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010203040506原始图象文件(Cy3/Cy5)→定位→栅格处理(griding)→数据自动提取→数据入表达谱数据库→原始数据标准化(normalization)Ratio值分析Cluster分析显著性表达差异基因具有相似表达谱基因数据分析流程图Experimentgroup/control:01Hepacellularcarcinoma/Normalliver02Red:明显上调03Yellow:差异不显著04Green:明显下调05信号叠加图假阴性：一般不关心，但也要看实验目的假阳性：验证基因芯片结果需要传统方法的验证010203
新一代芯片技术
光纤微珠芯片
ScreeningUnlabeledDNATargetswithRandomlyOrderedFiber-OpticGeneArrays,Steemers,F.J.,Ferguson,J.A.,Walt,D.R.,NatureBiotechnology,18,91-94,2000.Techview:MolecularBiology.Bead-BasedFiber-OpticArrays,Walt,D.R.,Science,287,451-452,2000DecodingRandomlyOrderedDNAArrays,KevinL.Gunderson,GenomeResearch,14:870-877,2004.微珠光纤微珠芯片---技术原理3.1um无孔无荧光硅珠每个微珠单独质控有效的反应表面积和体积比低/无背景大小均一PM-MM探针设计的优势将已克隆的转录产物以不同的浓度掺入到组织样品中。经过标记的样品与AffymetrixGenechip人类基因组芯片杂交，在克隆转录产物浓度低于8pM时，PM单独探针无法探测出相应的浓度变化，而与MM探针联合使用则可以探测出。灵敏度的提高双链探针在液相条件下自我复性从而大大降低与固着的靶DNA杂交的机会，从而降低了探测灵敏度，因此需更多的探针量。单链，使杂交灵敏度提高单链和双链探针基因芯片实验流程及方法cDNAmicroarrayTWOCHANNELMICROARRAYAffymetrixExpressionAnalysisReverseTranscriptaseinvitrotranscription01mRNA02cDNA03FragmentationofcRNA04cRNA05GeneChipHybridization06标记07实验过程样本制备样本标记预杂交杂交洗涤染色（如生物素标记）扫描数据分析HybridizationprocessofGeneChip?LLLLabelingcRNAfragmentLLHybridizationmixtureEukaryoticHyb.ControlControlOligoB2hybridization（16hour）DataanalysisScanWashstain基因芯片实验中的RNA抽提大都采用分子生物学中传统的方法，但要求必须能够尽可能多的抽提出组织中的RNA分子，保持实验数据信息与组织中mRNA拷贝数信息之间的平行性。02表达谱基因芯片研究的对象是样本中的mRNA，抽提出的mRNA需要经过反转录酶的作用转变为cDNA，同时进行荧光标记，标记好的cDNA靶分子就可用于杂交。01样本制备两步法：从样本中制备总RNA，再从总RNA中分离mRNA,总RNA中包括rRNA、tRNA和mRNA，其中９０％以上是rRNA和tRNA，分离mRNA的原理一般利用真核生物的mRNA的３’端都有polyA尾，用poly（dT）-纤维素亲和层析纯化mRNA。一步法：从组织样本中直接用poly（dT）-纤维素亲和层析纯化mRNA，这种方法简便，但RNA的纯度不够，当组织量少或对RNA质量要求不高时可采用12mRNA的纯化方法mRNA逆转录合成cDNA时用poly（dT）作引物，可以直接用总RNA作为摸板进行逆转录标记，简化步骤，减少mRNA的损失，从而减少对组织的需求，也避免了从
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