高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程.docxVIP

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DB53/TXXXX—2022

高粱花叶病毒RT-PCR检测技术规程

1范围

本文件规定了高粱花叶病毒RT-PCR检测方法中涉及的仪器与耗材、试剂、检测样品的取样及对照设置、检测方法和结果判定等。

本文件适用于高粱花叶病毒（Sorghummosaicvirus，SrMV）侵染的植物样品的RT-PCR检测。

2规范性引用文件

本文件没有规范性引用文件。

3术语和定义

下列术语和定义适用于本文件。

3.1

高粱花叶病毒Sorghummosaicvirus

高粱花叶病毒（Sorghummosaicvirus，SrMV）属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Potyvirus），是引起甘蔗花叶病的主要病毒之一，英文名称为Sorghummosaicvirus，缩写为SrMV，参见附录A。

3.2

RT-PCR

反转录聚合酶链式反应（ReverseTranscriptionPolymeraseChainReaction，RT-PCR）的简称，是一种在体外利用反转录酶将RNA反转录为cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，以获得RNA特定片段。

4仪器与耗材

4.1仪器

主要仪器包含电子天平、恒温水浴锅、高速台式冷冻离心机、蛋白/核酸分析仪、PCR扩增仪、涡旋混匀器、微波炉、电泳仪、水平电泳槽、凝胶成像仪、可调微量移液器、研钵等。

4.2耗材

无核酸酶（Nuclease-free）的1.5mL和2.0mL离心管及0.2mLPCR管等。

5试剂

5.1常规试剂

液氮、焦碳酸二乙酯（DEPC）灭菌水或者RNase-free水、植物总RNA提取试剂盒、三氯甲烷、70%乙醇、异丙醇、无水乙醇等。

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5.2RT-PCR试剂

Oligo(dT)18引物（0.5μg/μL），RT-PCR反转录试剂盒，含溴酚蓝染料的2×EasyTaqPCRSuperMix聚合酶混合物。

5.3引物

5.3.1上游引物SrMV-F：5′-CATCARGCAGGRGGCGGYAC-3′，下游引物SrMV-R：5′-TTTCATCTGCATGTGGGCCTC-3′（R=A/G，Y=C/T）。

5.3.2用无核酸酶的水将上、下游引物分别配制成浓度为20μM的水溶液。

5.3.3目的扩增片段约为820bp。

5.4电泳缓冲液的配制

按以下步骤配制电泳缓冲液：

a)称取242g的Tris，先用300mL的ddH2O搅拌溶解后，加100mL0.5mol/L的EDTA水溶液配制50×TAE储存液；

b)用ddH2O将储存液稀释50倍配制1×TAE工作液；

c)称取Tris108g、硼酸55g、7.44g的Na2EDTA·2H2O，加入40mL0.5mol/L的EDTA水溶液，再用ddH2O定容至1000mL配制10×TBE储存液；

d)用ddH2O将储存液稀释20倍配制0.5×TBE工作液。

5.5扩增产物电泳检测试剂

1%左右（W/V）琼脂糖，核酸染料。

6检测样品的取样及对照设置

6.1阳性对照

以SrMV侵染的植物样品作为阳性对照。

6.2阴性对照

以健康植物样品作为阴性对照。

6.3空白对照

以灭菌ddH2O作为空白对照。

6.4取样

戴一次性手套采集甘蔗叶片或芽作为待检样品，且每采一个样品跟换一次手套，过程中不应交叉污染。

将采的集样品放入自封袋中，编号，冷藏运输到实验室液氮速冻后，于-80℃冰箱保存备用。

7检测方法

7.1总RNA提取

总RNA提取步骤如下：

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a)戴一次性手套称取0.1g待测样品置于灭菌研钵中，液氮冷冻，研磨至粉状后放入1.5mL离心管中，并对每支管进行编号；

b)用核酸提取试剂盒提取样品总RNA，按提取试剂使用说明书进行操作；

c)提取后用蛋白/核酸分析仪测定RNA相对浓度，当A260/A280比值为1.8～2.0时，可用于RT-PCR检测。

7.2反转录

按以下步骤进行反转录：

a)以提取的总RNA为模板，在PCR管中按序依次加入：Oligo(dT)18引物约0.5μL、RNA模板约2.0μL（约200ng）、反转录试剂、灭菌DEPC水补足10μL反转录反应体系，混匀；

b)2000