DB12T 1019-2020 猪德尔塔冠状病毒 RT-PCR 检测方法.docxVIP

ICS65.020.30B41

DB12

天津市地方标准

DB12/T1019—2020

猪德尔塔冠状病毒RT-PCR检测方法

RT-PCRassayfordetectionofporcinedeltacoronavirus

2020-12-28发布2021-02-01实施

天津市市场监督管理委员会发布

DB12/T1019—2020

I

前言

本标准按照GB/T1.1-2009给出的规则编写。本标准由天津市农业农村委员会提出并归口。本标准起草单位：天津市畜牧兽医研究所。

本标准主要起草人：李秀丽、鄢明华、郑丽、路超、田向学、张莉、李富强、江珊、任卫科、董志民。

DB12/T1019—2020

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猪德尔塔冠状病毒RT-PCR检测方法

1范围

本标准规定了猪德尔塔冠状病毒（porcinedeltacoronavirus，PDCoV）RT-PCR检测方法的原理、仪器设备与试剂、样品对照、方法步骤和结果判定等技术内容。

本标准适用于猪肠内容物、粪便以及细胞培养物中PDCoV核酸的检测。

2缩略语

下列缩略语适用于本文件。

PDCoV：猪德尔塔冠状病毒（porcinedeltacoronavirus）PCR：聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）

RT-PCR：反转录聚合酶链式反应（reversetranscription-polymerasechainreaction）RNA：核糖核酸（ribonucleicacid）

DNA：脱氧核糖核酸（deoxyribonucleicacid）cDNA：互补脱氧核糖核酸（complementaryDNA）PK-15细胞：猪肾细胞（porcinekidneycell）DEPC：焦炭酸二乙酯（diethylpyrocarbonate）Taq酶：TaqDNA聚合酶（TaqDNApolymerase）

dNTP：脱氧核糖核苷三磷酸（deoxy-ribonucleosidetriphosphate）M-MLV：莫洛尼氏鼠白血病病毒（moloneymurineleukemiavirus）PBS：磷酸缓冲液（phosphatebuffersolution）

TAE：Tris-乙酸电泳缓冲液（trisacetate-EDTAbuffer）

3原理

PDCoV是一种RNA病毒。RNA反转录产生的cDNA可作为PCR模板进行扩增。根据PDCoVM基因保守基因序列设计一对引物，在DNA聚合酶催化下，以母链DNA为模板，以引物为延伸起点，通过变性、退火和延伸，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA。依据PCR试验结果，判断样品中是否含有PDCoV。

4主要仪器设备

生物安全柜、组织研磨机、涡旋振荡器、台式低温高速离心机、PCR仪、电泳仪、凝胶成像系统、分析天平（精度0.01g）、超低温冰箱（-80℃)等。

5试剂与引物

5.1试剂

DB12/T1019—2020

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Trizol、氯仿、异丙醇、乙醇、M-MLV反转录酶、RNA酶抑制剂、DEPC处理的灭菌去离子水、TaqDNA聚合酶、dNTP、DL2000DNAMarker、核酸染料、磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L，pH7.2）、TAE电泳缓冲液、琼脂糖。相关溶液配制方法见附录A。试剂均为分析纯。

5.2引物

PDCoVM基因PCR扩增方法所用引物见表1：

表1PDCoVM基因PCR扩增方法引物

引物名称

引物序列

引物浓度

扩增产物大小

上游引物P1

5-ATTCTGCTTTGGCTGCTC-3

10μmoL/L

359bp

下游引物P2

5-TCCTGTGGCGGATTTC-3

10μmoL/L

6样品对照

样品对照如下：

——阳性对照样品：PDCoV接种的PK-15细胞培养物；——阴性对照样品：正常PK-15细胞培养物。

7方法步骤

7.1样品的采集及处理

7.1.1采样工具

1.5mL离心管、剪刀、镊子和棉拭子，经121(±2）℃,15min高压灭菌，50℃~60℃烘干备用。

7.1.2采样方法

肠及肠内容物：选择空肠或回肠肠段，用绳子将肠两端扎紧，用剪刀采集肠及肠内容物等，放入一次性灭菌容器。

粪便：取发病猪新鲜粪便或者将棉拭子深入肛门转一圈蘸取粪便，将采集后的样本放入盛有0.5mLPBS溶液的1.5mL