基因工程的酶学基础.ppt

2.连接条件*必须是两条双链DNA01DNA3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P）01需要能量动物或噬菌体中：ATP大肠杆菌中：NAD+01（4）DNA连接酶的反应条件*Tris-HCl50-100mM，pH7.5MgCl210mMATP0.5-1mMDTT5mMVolume10-20mlTT4-15℃，4-16hr1UDNA连接酶的酶活性：在最佳反应条件下15℃反应1小时，完全连接1mgl-DNA（HindⅢ片段）所需的酶量。三、连接反应的机理*1.ATP（NAD+)提供激活的AMP。2.AMP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi（NMN）。3.AMP与连接酶的赖氨酸?-氨基相连。OC-C-CH2-CH2-CH2-CH2-NH2++H3NAMPATPPPi4.AMP随后从连接酶的赖氨酸?-氨基转移到DNA一条链的5’端P上，形成“DNA-腺苷酸”复合物。-OHHO-P-AMP-OHO-P-AMP3’-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二酯键，释放出AMP。四、连接反应的温度*01021.最佳温度连接酶反应的最佳温度是37?C。2.实用温度但在37℃下粘性末端的结合很不稳定。所以一般采用4~16?C五、影响连接反应的因素*10~20倍两种构型：线状分子和环状分子1.DNA末端的浓度增加插入片段与载体的接触机会，减少同一个分子末端自我连接的现象。与DNA浓度及DNA分子长度相关2.插入片段与载体的浓度比例3.反应温度*黏性末端：12～16℃平头末端：10～20℃一般，ATP最适的终浓度为0.5mmol/L.ATP浓度ATP浓度高至5mmol/L，影响平头末端的连接ATP浓度高至7.5mmol/L，抑制粘性末端及平头末端的连接。DNA连接的反应体系01酶切纯化后的DNA片断连接缓冲液DNA连接酶02七、平头双链DNA片段的连接操作*从分子动力学的角度讲，由限制性核酸内切酶创造的粘性末端的连接属于分子内部的连接，而平头末端的连接则属于分子间的连接，因此后者反应速度要慢得多。加入单价阳离子（NaCl），最终浓度150-200mM加大平头末端底物的浓度，增加分子间碰撞机会加入10%PEG8000，促进大分子之间的有效作用提高平头末端连接效率的方法包括：加大连接酶用量（10倍大于粘性末端的连接）第三节DNA聚合酶DNA聚合酶（DNApolymerase)能在引物和模板的存在下，把脱氧核糖多核苷酸连续地加到双链DNA分子引物链的3’－OH末端，催化核苷酸的聚合作用.logo基因工程中常用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶KlenowfragmentT7DNA聚合酶T4DNA聚合酶修饰过的T7DNA聚合酶逆转录酶TaqDNA聚合酶使用的时候要特别注意！*EcoRI和BamHI等都有*活性。GAATTCEcoRI：在低盐、高pH（8）时可识别和切割GAATTA、AAATTC、GAGTTC等010302诱发星号（*）活性的原因ⅰ）高甘油含量ⅱ）内切酶用量过大ⅲ）低离子强度ⅳ）高pHⅴ）含有机溶剂，如乙醇ⅵ）Mn2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+等二价阳离子的存在酶量不宜过多，尽量遵循生产商推荐的反应条件123[8]Ⅱs型限制性内切酶*01在离它的不对称识别位点一侧的特定距离处切割DNA双链。02移动切割（shiftedcleavage):03GACGCNNNNN?04HgaI05CTGCGNNNNNNNNNN?065’073’（3）Ⅱ型限制性内切酶不具有甲基化功能Ⅱ型酶的甲基化修饰活性由相应的甲基化酶承担。它们识别相同的DNA序列，但功能不同。如EcoRI限制性内切酶和EcoRI甲基化酶前者：5’-G?AATTC-3’3’-CTTAA?G-5’后者：5’-GAA*TTC-3’3’-CTT*AAG-5作用的位点也不相同1II型限制性内切酶对单链DNA的切割2定义为切割双链DNA，但有一些还可以特异识别并切割单链DNA的相应位点，只是切割效率比较低3如：HhaⅠ切割单链DNA比切割双链DNA效率低50％核酸限制性内切酶的类型及主要特性*特性Ⅰ类内切酶Ⅱ类内切酶Ⅲ类内切酶限制和修饰活性单一多功能的酶内切酶和甲基化酶分开共同亚基的双功能酶内切酶的蛋白结构