克隆抗体和抗体工程.ppt

五、抗体酶抗体酶(abzyme)：应用于单克隆技术生产的兼具抗体及酶催活性的工程蛋白质。也就是说，其行为如同蛋白酶一样，能够催化化学反应的一类新型的抗体。抗体酶的制备(自学)ImmunotoxinsProteintoxinconnectedtoFvregion添加标题Toxinlocalizedtoantigen-expressingcells添加标题Single-chainorS-SlinkedFvregion添加标题logo未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合B淋巴细胞：HGPRT+，TK+在HAT培养液中，未融合的效应B细胞和两个效应B细胞融合的“D途径”被氨基喋呤阻断虽“S途径”正常，但因缺乏在体外培养液中增殖的能力，一般10d左右会死亡。2、骨髓瘤细胞以及自身融合细胞骨髓瘤细胞HGPRT－，TK－在HAT培养液中，因此自身没有“S途径”“D途径”又被氨基喋呤阻断，所以在HAT培养液中也不能增殖而很快死亡。3、杂交瘤细胞骨髓瘤细胞HGPRT-，TK-既具有效应B细胞的“S途径”，又具有骨髓瘤细胞在体外培养液中长期增殖的特性。在HAT培养液中，选择性存活下来，并不断增殖。浆细胞自发或诱发突变脾B细胞用SRBC免疫(注射X蛋白)不能在HAT培养基上生长的骨髓细胞(带有X蛋白的抗体)细胞融合转到HAT培养基上非融合细胞死亡杂交瘤细胞生长在多孔塑料板孔内培养单个细胞(HAT培养液)培养2周杂交瘤细胞可继续繁殖优良杂交瘤细胞检测单克隆抗体接种动物,大量生产单克隆抗体细胞大量培养罐大量生产克隆抗体冷冻保藏淘汰不合格的细胞亲代死亡三、筛选阳性克隆与克隆化添加标题产生特定抗原的抗体产生细胞只占所有脾细胞的5%左右。添加标题筛选技术：免疫酶技术、免疫荧光技术和放射免疫技术。添加标题免疫酶技术和放射免疫技术均适用于可溶性抗原及颗粒性抗原的抗体检测。添加标题免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测。筛选阳性克隆：1、精制破伤风毒素抗原（）吸附（约10?g/ml，4℃，3h）洗涤2、加杂交瘤培养上清液（）（4℃，1h）3、加辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠抗体（）（4℃，1h）洗涤洗涤4、加酶作用底物，呈色孔为阳性克隆孔ELISA用于破伤风抗体的筛选杂交瘤细胞培养细胞向培养基中分泌抗体收集培养基预先包埋好目标抗原的培养板抗原与抗体的结合EEEEE加入二抗显色说明有抗体的存在在酶的情况下,与二抗结合的分子产生特殊的颜色(ELISA)（2）克隆化——有限稀释法和软琼脂法筛选出来的阳性克隆中，可能含有不分泌抗体的细胞或有多株分泌抗体的细胞，而且刚刚融合获得的杂交瘤细胞不稳定，染色体容易丢失，因此应尽早克隆化。杂交瘤细胞要经过大约3次的克隆化，才能达到100%孔内均为抗体阳性细胞克隆。常用的克隆化方法有有限稀释法和软琼脂法。有限稀释法：是把杂交瘤细胞悬液稀释后，加入到96孔细胞培养板中，使每个孔中在理论上只含有一个细胞。添加标题第一次克隆化时也要应用HT培养液，以后的克隆化可用不含HT的RPMI1640培养液。添加标题单个细胞难以存活，克隆化时也需加入饲养细胞辅助其生长。添加标题软琼脂法：在培养液中加入0.5%左右的琼脂糖凝胶，细胞分裂后形成小球样团块。01培养基是半固体状态，可用毛细吸管将小球吸出，团块打碎后，移入96孔板中继续培养。02这种方法可以吸出大量克隆细胞进行培养，因初代细胞很不易增殖，所以用软琼脂法进行克隆化容易成功。03三、杂交瘤细胞的鉴定添加标题01单击此处添加小标题02单击此处添加小标题03单击此处添加小标题04染色体鉴定:正常小鼠脾细胞的染色体数目为40,而小鼠骨髓瘤细胞的染色体数目的变异较大，可以有62～68条染色体。特性鉴定:对单克隆抗体的亲和力的鉴定是最重要的,一般采用酶联免疫吸附测定(ELISA)法。类别鉴定:可以用相应的抗血清及双向免疫扩散法进行鉴定;单克隆抗体的纯度鉴定:可以用有还原剂或者无还原剂条件下的SDS-PAGE电泳进行鉴定。体外培养法可获得10?g/ml的抗体；动物体内诱生法，可获得5~20mg/ml的抗体。目前多采用此法生产制备单克隆抗体。优点：操作简便、比较经济、所得抗体量多、所得单克隆抗体量较多且效价亦高，还可有效地保存杂交瘤细胞株和分离已污染杂菌的杂交瘤细胞株，缺点：小鼠腹水中混有来自小鼠的多种杂蛋白，给纯化带来难度。四、单克隆抗体的大量制备大量培养方法：利用悬浮培养方式可增加细胞生长空间，杂交