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生物制品中的宿主细胞蛋白（HCP）残留检测

背景

宿主细胞蛋白（HostCellProtein，HCP）是指在不同的基于细胞的表达系统，如细菌(大肠杆菌、荧光假单胞菌)、酵母(酿酒酵母、毕赤酵母)、哺乳动物细胞(中国仓鼠卵巢细胞(CHO)、小鼠骨髓瘤细胞(NSO))用于生产生物药物的过程中，宿主细胞中存在的与目标蛋白不相关的蛋白质。HCP属于工艺相关杂质，与产品相关杂质不同，产品相关杂质是指在生产/贮存过程中产生的分子变异体(如前体、某些降解产物)，而工艺相关杂质是指在生产过程中产生的杂质，如细胞基质(宿主细胞蛋白、宿主细胞DNA)、细胞培养物(抗生素或培养基成分)或下游工艺产生的杂质（ProteinA）。

宿主细胞蛋白残留可能引起机体的免疫反应（如过敏性反应、过敏性休克等），同时一些具有酶活性的HCP可能影响终产品中的蛋白质的组成及产品的稳定性，其对生物制品的质量、安全性与有效性有着重要的影响，被列为产品质量控制的关键质量属性（CriticalQualityAttributes,CQA）。为了有效控制和监测宿主细胞蛋白的残留，通常采用多种策略，包括工艺改进、培养条件优化、宿主细胞工程和蛋白纯化技术的改进等。监测宿主细胞蛋白的残留通常使用多种分析技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）、质谱分析（MassSpectrometry）和基于免疫学方法的定量检测等。这些方法可以有效地鉴定和定量残留的宿主细胞蛋白，从而有助于生物制药企业确保产品的质量、安全性和有效性。

HCP的特点及影响因素

在工艺相关杂质中HCPs的分析与控制一直是难点，主要由于其并非是单一某个种类的蛋白质，在上游样品中HCPs的数量甚至可以多达上千种，与宿主细胞、培养条件及相关工艺密切相关。HCPs不具备均一的理化特性，其分子量分布范围广泛(从5kda到至少250kda)，等电点pI(3-11)及疏水性均不同，对分析与监控提出较高的挑战。

表1主要影响HCPs的因素[5]

检测方法

宿主细胞蛋白（HostCellProtein，HCP）的残留可以通过多种方法进行检测，下面列举了一些常用的宿主细胞蛋白检测方法：

1.酶联免疫吸附测定（ELISA）

酶联免疫法（ELISA）是目前HCP检测最常用的方法，在2020版《中国药典》通则3412/3413/3414中提到的宿主蛋白残留检测方法均为ELISA法。ELISA法可以定量检测HCP的总量，大多采用多克隆抗体设计的夹心ELISA法，方法原理参考前文ELISA方法简介及分类。该方法通过将宿主细胞裂解蛋白或者培养基中的上清液注射到动物体内产生免疫，获得用于测定HCP的多克隆抗体，利用特定的抗体与宿主细胞蛋白发生特异性结合，并通过酶标记的二抗及底物进行定量测定。ELISA方法对宿主细胞蛋白的敏感性和特异性较高，可以满足许多生物制药产品的检测需求，但并不是所有HCP都能与生产的多克隆抗体产生免疫反应，因此ELISA法不能覆盖所有HCP蛋白。

ELISA方法在HCP检测中的开发及验证可以参考USP通则1132以及2020版《中国药典》通则9101，关于HCPELISA方法开发策略，推荐在临床前及临床I期、II期阶段，使用商业化检测试剂盒，但在临床III期及NDA阶段，首选专属性检测试剂盒或平台型检测试剂盒。因其所检测的抗原为高度复杂的混合抗原，数量高达上千种，所用抗体对HCP抗原的覆盖率对检测结果与真实HCP含量的接近程度存在直接影响。如果在临床III期和批准后阶段使用商业化检测试剂盒，则必须充分证明检测试剂适用于工艺HCP。

图1?HCPELISA方法开发策略[1]

2.质谱分析（MassSpectrometry）

质谱分析是一种高灵敏度的宿主细胞蛋白检测方法，应用于生物制药生产工艺中HCP的监测，可提供比ELISA更全面的宿主细胞蛋白谱，与ELISA方法形成互补，弥补ELISA方法存在的不足，但此法需要较为精密的仪器和复杂的数据分析技术。该方法通过将样品中的蛋白质离子化，然后利用质谱仪测定离子的质荷比，从而定性和定量分析残留的宿主细胞蛋白。质谱法通过将蛋白裂解为肽段来进行检测，这种方法借鉴了蛋白质组学分析的理念，其流程大致分为：样品前处理、样品分离、数据采集与分析。2023年USP在第三期药典论坛推出通则1132.1，作为1132的延伸和补充，从样品的制备、色谱分离、质谱分析等方面详细介绍了LC-MS/MS液相质谱联用方法。

图2基于质谱法的HCP检测流程图[6]

3.免疫印迹（WesternBlotting）

免疫印迹（WesternBlotting）是一种常用的蛋白质检测方法，可用于宿主细胞蛋白的鉴定。该方法通过蛋白质电泳分离和转移至膜上，然后使用特异性抗体与目标蛋白结合。免疫印迹可以定性和半定量