酶联免疫吸附实验报告.pdf

酶联免疫吸附试验

【小组成员】潘晓娟）陈怡静）李永乐）袁理）

【实验原理】酶联免疫吸附试验为酶免疫技术的一种，是在固相载体上进行的免疫酶技术。

其理论依据为：抗原或抗体可吸附固相载体（聚苯乙烯微量细胞培养板）表面而不改变其特

性；抗原或抗体与酶交联后，仍保持其结合活性，同时酶的催化活性不改变；特异性抗原抗

体结合后，标记的酶可高效催化底物水解、氧化或还原，产生有色物质，其颜色深浅与相应

的抗体或抗原量相关。

【实验设计】酶联免疫吸附试验有多种设计方案，本组采取抑制ELISA设计：

正常兔血清→兔抗鼠IgG*+HPR-羊抗兔Ig→显色

按照实验原理，若未加入未知抗原时，正常兔血清与酶标抗体结合后吸附在固相载体表面，

能使后来加入的底物发生氧化还原反应而显色。若先将未知抗原与酶标羊抗兔IgG反应，

如未知抗原中含有能与酶标羊抗兔IgG反应的抗原，则正常兔血清能与酶标羊抗兔IgG结

合量减少，底物显色变浅，甚至不变色。

鉴于此次为首次进行酶联免疫吸附试验，包被物正常兔血清与未知抗原兔抗鼠IgG二者的

最佳反应稀释度均未知，故实验采取4个不同稀释度的正常兔血清与4个不同稀释度的兔抗

鼠IgG进行交叉，并设置了只含稀释液和酶标羊抗兔IgG的空白对照组。

【实验材料】1:200正常兔血清、1:200兔抗鼠IgG、1:200HPR-羊抗兔Ig、包被液、封闭液、

洗涤液、底物缓冲液（TMB）、终止液、聚苯乙烯微量细胞培养板、微量加液器、10μL

加样器头、100μL加样器头、洗瓶、吸水纸、水浴箱。

【实验方法】

1、稀释：按照加孔数计算稀释时所需正常兔血清与稀释液的量，倍比稀释1:200正常兔血

清至1:1000、1:2000、1:4000、1:8000四个稀释度；

2、包被：按下图所示，用100μL加样器头往聚苯乙烯微量细胞培养板中加入不同稀释度

血清100μL/孔，置于4°C冰箱保存过夜；

正常兔血清稀释度

1:10001:20001:10001:20001:10001:20001:10001:2000稀释液稀释液

1:40001:80001:40001:80001:40001:80001:40001:8000稀释液稀释液

3、干燥：取出已包被过夜的培养板，倒掉多余的包被液，甩干后用吸水纸吸掉多余水分；

4、封闭：加入150μL/孔的封闭液，放入37°C恒温箱30min；

5、稀释：按照加孔数计算稀释时所需1:200兔抗鼠IgG与稀释液的量，倍比稀释1:200兔

抗鼠IgG至1:1000、1:2000、1:4000、1:8000四个稀释度；

6、干燥：取出培养板，以洗涤剂冲洗3次，每次3min，用吸水纸吸掉多余水分；

7、加液：按下图所示，加入已倍比稀释的兔抗鼠IgG50μL/孔和1:200HPR-羊抗兔Ig50μ

L/孔（无需稀释后加入），对照组只加入1:200HPR-羊抗兔Ig50μL/孔，放入37°C恒温箱

30min；

1:1000/1:1000/1:2000/1:2000/1:4000/1:4000/1:8000/1:8000/HPR-羊HPR-羊HPR-羊

HPR-羊HPR-羊HPR-羊HPR-羊HPR-羊HPR-羊HPR-羊HPR