全国结核病细菌学诊断培训.pptVIP

培养SolidmediaAgarplatesForIdentificationForEnumerationSlopesForsafelong-termculture,e.g.Lowenstein-JensenmediaforTBLiquidmedia(broth)Forenrichmentormaximumsensitivity菌种鉴定形态学生长条件生化反应酶抗原分子生物学方法血清学检测01分子生物学方法02其他（HPLC）03非培养的诊断方法噬菌体生物扩增法将分枝杆菌噬菌体感染结核分枝杆菌，未进入菌体内的噬菌体用特异的抗噬菌体物质灭活，进入菌体内的噬菌体得到保护而复制增殖，溶菌后释放子代噬菌体，将此噬菌体与快速生长的耻垢分枝杆菌混合，接种在固体培养基上培养，观察蚀斑的产生。蚀斑的数量与噬菌体数量有关，也与在含抗结核药物培养基上存活的结核分枝杆菌数有关。01噬菌体法（Fastflaque)02噬菌体生物扩增法原理示意图噬菌体荧光素酶检测法Jacobs等将荧火虫荧光素酶基因导入分枝杆菌噬菌体，这种噬菌体感染分枝杆菌后，荧光素酶基因被代谢活跃的分枝杆菌活化，在菌细胞内ATP存在的条件下，可产生光子，通过荧光检测器测定发光信号。只有耐药的分枝杆菌才能在含药的培养墓上生长，产生光子，敏感菌和死亡菌不产生或产生后不能维持。01GenProbe方法检测结核分枝杆菌02原理菌种鉴定RNA/RNA错配法Nash等(1997)首先将该法用于RFP耐药菌株培养物的检测。该法是基于双链RNA能抵杭RNA酶的消化的原理而建立的。将待检菌株以及药物敏感的参考菌株(H37Rv)的PCR产物混合，加入T7RNA多聚酶和SP6RNA多聚酶，通过转录形成两条RNA，在进行杂交，若待检测株为敏感株，则形成两条互补的RNA，能抵抗RNA酶的消化，若待检测菌株有突变发生，则不能与参考株RNA链完全配对，加入RNA酶后，杂交产物将在突变位点被切开，通过电泳即可检测到。RussiaBrazilTokyoSwedenBirkhaugDanishPragueGlaxoTiceFrappierConnaughtPhippsPasteurAlphaMethoxyKeto300bp200bp100bpBehretal.JBacteriol,2000-A-A-T-T-C-G-C-G-A-T-G--T-T-A-A-G-C-G-C-T-A-C-Bactec放射呼吸测定以含有放射标记的软脂酸为底物的液体培养基，自动测量分枝杆菌代谢14C软脂酸脱致过程中释放的14CO2的量。该法药敏报告可缩短为4一12天。分枝杆菌生长指示管法Bactec放射呼吸测定法的替代方法。以培养基中加入荧光钌复合物代替放射性标记，其荧光衰减与细菌代谢过程中O2的消耗量有关。荧光衰减可通过一系列不同的紫外透照管检测。Bactec呼吸测定0102流式细胞仪测定法原理:分枝杆菌细胞内的非特异性脂酶能水解培养基中加入的荧光素复合物(FDA)为游离的荧光素，因而分枝杆菌在生长过程中可造成荧光素的堆积，经FCM即可检测到。MTT法MTT法为线粒体琥珀酸脱氢酶的作用底物，可被活细胞还原形成不溶性的Formazan产物,其生成量与活细胞数量成正相关。Formazan经溶解后，可在酶标仪上测定其光吸收值。微孔板美兰比色法美兰为耗氧指示剂，有氧时为蓝色，无氧时为粉红色。Franzblau等以美兰为指示剂在96孔微量板中培养细菌，培养基中加入抗结核药物，微量板用Parafilm封口膜封闭。若细菌为药物敏感株，可被加入的抗结核药物抑制或杀死，首先表现为氧消耗停止。而耗氧指示剂在各独立微小隔氧环境中的颇色变化可客观反映氧被消耗的程度，从而反映细菌的生长状态。比色法DNA测序法Hirano等应用DNA测序法DNA测序法被认为是检测变异的“金标准”，可检测出待检基因上的所有突变位置和突变情况。利用PCR法扩增待检基因，PCR产物可直接测序，24一48h即可提供精确序列，并准确判定碱基突变的位点，已用于RFP、INH、PZA、EMB等耐药基因的检测。基因芯片基因芯片将耐药基因的DNA或寡核苷酸序列标记到芯片上，从而快速的检测出突变位点，可以在3个小时内完成。DOTS(直接面视下的短程化疗)；全球范围的耐药结核病播散；与HIV的共同感染；流动人口中的结核病；针对结核病新的特异性药物；比BCG有效的新疫苗影响结核病控制的因素结核病与流动人口02耐药结核病01艾滋病和结核病