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不飞则已，一飞冲天；不鸣则已，一鸣惊人。——《韩非子》

实验九肝脏中转氨酶活力的测定

一、实验目的

1.了解转氨酶的性质和临床意义；

2.掌握谷丙转氨酶活力的测定方法

二、实验原理

本实验以丙氨酸的氧化脱氨基为例，分别测定谷丙转氨酶，谷氨酸脱氢酶活性外，又通过抑

制剂观察肝组织中的联合脱氨基作用。在谷丙转氨酶的催化下，丙氨酸和α-酮戊二酸作用生成丙

酮酸和谷氨酸。次反应可逆，平衡点近于1.0无论正向反应或逆向反应皆可用于测定此酶的活性，

既可测定所产生的氨基酸，也可以测定生成的酮酸，因此可有多种测定方法。

本实验以丙氨酸和α-酮戊二酸作为谷丙转氨酶作用的底物，利用内源性磷酸吡哆醛作为辅

酶，在一定条件及时间作用后测定所生成的丙酮酸的量来确定其酶活力。丙酮酸能与2,4-二硝基

苯肼结合，生成丙酮酸2,4-二硝基苯腙，后者在碱性溶液中呈现棕色，其吸收峰为439-530nm，

可用于测定丙酮酸的含量。

α-酮戊二酸也能与2,4-二硝基苯肼结合，生成相应的苯腙，但后者在碱性溶液中吸收光谱与

丙酮酸二硝基苯腙有差别，在520nm波长比色时，α-酮戊二酸二硝基苯腙的吸光度远较丙酮酸二

硝基苯腙为低（约相差3倍）。经转氨基作用后，α-酮戊二酸减少而丙酮酸增加，因此在波长为520nm

处吸光度增加的程度与反应体系中丙酮酸和α-酮戊二酸的摩尔浓度呈线性关系，故可借此测定谷

丙转氨酶的活力。

三、实验材料、试剂和仪器

（一）材料与试剂

猪肝脏、乙醇、0.4mol/LNaOH

标准丙酮酸溶液（1mL相当于500μg）：准确称取纯化的丙酮酸钠62.5mg，溶于100mL的

0.05mol/L的H2SO4中，此液需临用前配制。

谷丙转氨酶底物：称取L-丙氨酸0.90g及α-酮戊二酸29.2mg，先溶于pH7.4的0.1mol/L磷酸

缓冲液中，然后用1mol/LNaOH调至pH7.4，再加pH7.4的0.1mol/L磷酸缓冲稀释至100mL，贮

藏于冰箱内，可保存一周。（试验了一下pH接近7.5，中间未调整pH值）

0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH7.4）：称取13.97gK2HPO4（如果是K2HPO4·∙H2O，则需称取

18.31g）和2.69gKH2PO4溶于1000mL蒸馏水中。

0.02%2,4-二硝基苯肼溶液：称取2,4-二硝基苯肼20mg溶于少量1mol/L盐酸中，加热溶解后，

利用1mol/L盐酸稀释至100mL。

（二）仪器/器具

电子天平、分光光度计、剪刀、移液管、组织破碎机

四、实验步骤

1.肝匀浆制备与稀释

不飞则已，一飞冲天；不鸣则已，一鸣惊人。——《韩非子》

将猪肝用生理盐水冲洗，滤纸吸干，称取肝脏0.5g，剪成小块，置于烧杯内，加入4.5mL预

冷的pH7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液，制成10%肝匀浆，冰冻保存备用。吸取上述肝匀浆1mL，加

入预冷的pH7.4的0.1mol/L磷酸缓冲液49mL（即稀释50倍）摇匀，作为实验中使用的稀释肝匀

浆（室温中放置时间过久，会引起酶活性下降或失活因此需现用现配制，且放置时间不宜过久）。

2.谷丙转氨酶活力的测定

（1）取试管4支，分别标“测定管A”、“对照管B”、“标准管S”，“空白管”按下表进行操作。

测定管A标准管S对照管B空白管O