原核生物分子克隆的宿主和载体系统.pptVIP

一、噬菌体的生物学*λ噬菌体颗粒中的DNA是一线性双链DNA分子，长48502bp。基因簇集排列线λ噬菌体上有些基因可被取代而不影响其生活周期线性λ噬菌体两端各有12个碱基的5’凸出黏性末端是互补的,该互补序列相互作用形成cos位点。作用：进入细胞的λDNA通过两端的黏性末端环化。作为内切酶的识别位点*对野生λ噬菌体的改进二、基于λ噬菌体的克隆载体*A删除多余的限制性内切酶的位点。B、切除一些非必需序列，增加载体的容量。C设计阳性选择重组子的方法。D设计可方便地通过转录作用制备外源插入DNA的RNA探针的载体E发展可以使插入的真核cDNA与β－半乳糖苷酶形成融合蛋白的载体。2、λ噬菌体基因组可删除的部分不影响生存能力二、基于λ噬菌体的克隆载体*λ噬菌体基因组中可以删除的序列与噬菌体进入从裂解状态进入溶源状态以及从溶源状态进入裂解状态有关，即与噬菌体整合和脱离大肠杆菌的染色体相关删除了这部分序列的噬菌体只能进行裂解循环二、基于λ噬菌体的克隆载体*λ噬菌体载体可分为插入型载体：只具有一个可供外源DNA插入的克隆位点。失去了非必需区切点又位于报告基因上，故在切开DNA并插入外源基因后，报告基因失活，即可依此进行重组体的筛选可插入长度为10kb的外源DNA两种报告基因的插入型载体二、基于λ噬菌体的克隆载体*cI基因内保留HindIII和EcoRI单酶切位点，当有外源DNA在这酶切位点插入时，使cI基因失活，感染hfⅠ-大肠杆菌后可形成空斑（如λgt10）。在噬菌体DNA插入的lacZ基因末端设有单一的EcoRⅠ酶切位点。在此处插入外源基因，可表达β-半乳糖苷酶的融合蛋白，利用特异性抗体或DNA测序方法可筛选重组DNA。这类载体适宜构建cDNA文库(如λZAPII)0102二、基于λ噬菌体的克隆载体*替换型载体：具有成对的克隆位点，在这两个位点之间的λDNA区段可以被外源插入的DNA所取代。可克隆的片段大，最大可达23kb，而质粒最大仅10kb左右；λDNA的长度大于野生型λ噬菌体DNA长度的75％而不超过其105％时，才能被包装成噬菌体颗粒，当DNA的长度短于野生型的75%或超过105%时，噬菌体的活性就急剧下降，因此要求λ载体DNA和外源DNA长度之和在39～53kb之间。三λ克隆载体的体外包装*体外包装：模拟λ噬菌体DNA分子在宿主细胞内发生的包装过程，将重组的λ噬菌体DNA分子包装成成熟的具有感染能力的λ噬菌体颗粒必要性：λ噬菌体重组分子直接感染大肠杆菌的效率较低，而在试验过程中，因内切酶的处理，DNA的连接产生的有效分子等原因，使得转染效率更低三λ克隆载体的体外包装*三λ克隆载体的体外包装*单菌株体系缺陷型λ噬菌体在cos位点有突变，λ噬菌体的DNA复制不能完成，但可形成外壳蛋白，可以制备包装所必须的各种外壳蛋白。双菌株的体外包装原理三λ克隆载体的体外包装*λ噬菌体的头部和尾部的包装是分开进行01两种不同突变的噬菌体混合起来，能在体外装备形成有活性的噬菌体颗粒04头部基因发生突变的噬菌体只能形成尾部02尾部基因发生突变的噬菌体只能形成头部03Lyse,mixAddATPandconcatemerizedλDNAMaturephageparticles重组噬菌体的鉴别*lacZ‘基因功能选择方法类似于质粒中的蓝白斑筛选cI基因功能选择法cI插入失活的噬菌斑是“清澈”的，而野生型正常的噬菌斑是“浑浊”的5.4重组噬菌体的鉴别*Spi-（sensitivetoP2inhibition）正选择野生型λ噬菌体，不能在P2噬菌体溶源性细菌中生长，为Spi+，即对在P2噬菌体的抑制成敏感反应。λ噬菌体载体中的red和gam区段被外源片段取代后，λ噬菌体就能在P2噬菌体溶源性细菌中生长。基于λ基因组大小的筛选5.4重组噬菌体的鉴别*包装体系只能将大小37-52Kb的DNA分子插入到噬菌体的头部结构中插入型载体（第六章）通常删除了噬菌体的中非必须的基因部分，因此中有重组后介于37~52Kb的分子才能被包装。12M13噬菌一般特点二、M13噬菌体克隆载体*仅6407个核苷酸有双链环状，单链环状存在形式基因组采取滚环复制形式适合做载体具有比λ噬菌体更大的装载能力单链形式在某些实验过程很重要，如测序、体外突变等第四节外源DNA和载体的连接*一、外源DNA和载体连接的方法*互补黏性末端之间的链接同一限制酶切割位点连接：?由同一限制性核酸内切酶切割的不同DNA片段具有完全相同的末端。只要酶