纯化一多克隆抗体.pdfVIP

臣心一片磁针石，不指南方不肯休。——文天祥

我需要纯化一多克隆抗体.抗原是GST融合蛋白.

不知道谁有抗体纯化手册,给小妹一些建议好吗?不胜感谢

回复

抗体的纯化有很多中方法，帮你整理一些供你参考。

一、硫酸铵沉淀法

基本原理

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球

蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋

白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。

各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称

之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质

变性而应用最广。

试剂及仪器

·组织培养上清液、血清样品或腹水等

·硫酸铵（NH4）SO4

·饱和硫酸铵溶液（SAS）

·蒸馏水

PBS(·含0.2g/L叠氮钠)(见附录一)

·透析袋

·超速离心机

pH·计

·磁力搅拌器

实验步骤

以腹水或组织培养上清液为例来介绍抗体的硫酸铵沉淀。各种不同的免疫球蛋白盐析所需硫

酸铵的饱和度也不完全相同。通常用来分离抗体的硫酸铵饱和度为33%—50%。

（一）配制饱和硫酸铵溶液（SAS）

将767g（NH4）2SO4边搅拌边慢慢加到1升蒸馏水中。用氨水或硫酸调到pH7.0。此即

饱和度为100%的硫酸铵溶液（4.1mol/L,25°C）；

（二）沉淀

1、样品（如腹水）20000′g离心30min，除去细胞碎片；

2、保留上清液并测量体积；

3、边搅拌边慢慢加入等体积的SAS到上清液中，终浓度为1：1（v/v）；

4、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或搅拌过夜（4°C），使蛋白质充分沉淀。

（三）透析

1、蛋白质溶液10000′g离心30min（4°C）。弃上清保留沉淀；

2、将沉淀溶于少量（10-20ml）PBS-0.2g/L叠氮钠中。沉淀溶解后放入透析袋对PBS-0.2g/L

叠氮钠透析24-48小时（4°C），每隔3-6小时换透析缓冲液一次，以彻底除去硫酸氨；

3、透析液离心，测定上清液中蛋白质含量。

臣心一片磁针石，不指南方不肯休。——文天祥

应用提示

（一）先用较低浓度的硫酸氨预沉淀，除去样品中的杂蛋白。

1、边搅拌边慢慢加SAS到样品溶液中，使浓度为0.5:1(v/v)；

2、将溶液放在磁力搅拌器上搅拌6小时或过夜（4°C）；

3、3000′g离心30min（4°C），保留上清液；

4、上清液再加SAS到0.5:1(v/v)，再次离心得到沉淀。将沉淀溶于PBS，同前透析，除去

硫酸氨；

5、杂蛋白与欲纯化蛋白在硫酸氨溶液中溶解度差别很大时，用预沉淀除杂蛋白是非常有效

的；

（二）为避免体积过大，可用固体硫酸氨进行盐析（硫酸氨用量参考表1）；

（三）硫酸氨沉淀法与层析技术结合使用，可得到更进一步纯化的抗体。

二、DEAE离子交换层析法

基本原理

离子交换层析是蛋白质纯化的常规方法，与硫酸氨沈淀法联合使用可以非常有效地纯化抗体。

DEAE是一种阴离子交换剂，当蛋白质溶液通过DEAE柱时，带负电荷的蛋白质可以被DEAE

吸附，带正电荷的蛋白质则不被吸附而随溶液流出。纯化抗体时可