《DNA提取和pcr扩增》课件.pptVIP

***********基因工程技术的发展历程11972年伯格等人首次将来自不同生物的DNA片段连接在一起，标志着基因工程技术的诞生。21973年科恩和博伊尔首次构建了重组DNA分子，并将其导入大肠杆菌，实现了基因克隆。31978年人类首次利用基因工程技术生产出人胰岛素。41982年人类首次利用基因工程技术生产出基因工程药物。DNA提取的意义和原理科学研究了解基因结构、功能和表达，进行基因克隆、基因诊断等研究。医学诊断检测遗传病、肿瘤等疾病，进行病原体检测和药物研发。农业育种培育高产、优质、抗病虫害的农作物品种，提高农业生产效率。DNA提取的一般步骤1收集样本根据实验目的选择合适的样本类型，例如血液、组织、细胞等。2细胞裂解使用裂解液破坏细胞膜，释放出DNA。3去除杂质使用不同的方法去除蛋白质、脂类等杂质。4DNA沉淀使用乙醇或异丙醇将DNA沉淀出来。5DNA洗涤使用缓冲液洗涤DNA，去除残留的杂质。DNA提取的一般步骤包括收集样本、细胞裂解、去除杂质、DNA沉淀和DNA洗涤等。常见的DNA提取方法酚-氯仿法经典方法，利用酚-氯仿的性质将DNA分离出来，但操作繁琐，需要小心操作。盐析法利用高浓度的盐溶液将DNA沉淀下来，方法简便，但提取的DNA纯度不高。柱层析法利用硅胶膜吸附DNA，再用缓冲液洗脱，操作方便，提取的DNA纯度较高。磁珠法利用磁珠吸附DNA，操作简单，适合快速提取少量DNA。常见的DNA提取试剂和仪器试剂用于裂解细胞、去除蛋白质和沉淀DNA的试剂，如蛋白酶K、SDS、氯仿等。仪器用于研磨组织、离心、洗涤和定量DNA的仪器，如研磨仪、高速离心机、移液器、紫外分光光度计等。DNA提取的影响因素和注意事项样本类型样本类型对提取效率有很大影响。不同类型的样本需要使用不同的提取方法。样本保存样本的保存条件会影响DNA的完整性和质量，需要严格控制温度和湿度。试剂质量试剂的质量直接影响提取结果的准确性，使用高质量的试剂非常重要。操作规范严格按照操作步骤进行实验，避免污染和误操作，确保提取结果的可靠性。DNA浓度和纯度的测定方法原理优点缺点紫外分光光度计法基于DNA在260nm波长处最大吸收快速、简便受蛋白质等杂质影响荧光染料法利用荧光染料与DNA结合，测量荧光强度灵敏度高、可用于微量DNA检测需使用专门的仪器电泳法基于DNA片段大小不同，在电场中迁移速度不同可同时测定DNA浓度和完整性操作较繁琐电泳技术在DNA分析中的应用DNA片段分离根据DNA片段的大小进行分离，便于分析其大小和数量。基因突变检测通过比较正常和突变基因的电泳图谱，可以检测出基因突变。基因表达分析通过比较不同样本的DNA表达水平，可以分析基因表达差异。PCR反应的原理和步骤1DNA复制利用DNA聚合酶和引物，在模板DNA的指导下合成新的DNA链。2循环重复DNA的变性、退火和延伸三个步骤，使DNA片段指数级扩增。3产物分析通过电泳等方法分离和检测PCR产物，确定目标基因的存在和数量。PCR扩增的应用领域医学诊断通过PCR检测病原体，例如病毒、细菌和寄生虫，用于疾病的诊断和监控。遗传病检测通过PCR检测特定基因突变，用于遗传病的诊断、基因携带者筛查和产前诊断。法医鉴定通过PCR分析DNA指纹，用于个人身份识别、亲子鉴定和犯罪案件调查。生物研究通过PCR克隆、基因表达分析和基因敲除等技术，用于生物研究。PCR引物的设计原则特异性引物应与目标序列特异性结合，避免与其他非目标序列发生交叉反应。这可以保证PCR扩增的准确性和特异性。长度和Tm值引物长度通常在18-30个碱基之间，Tm值在55-65℃之间，确保引物与模板DNA的有效结合，并使PCR反应效率最佳。GC含量引物中GC含量应在40%-60%之间，避免引物内部形成二级结构或与模板DNA形成非特异性结合。PCR反应体系的组成模板DNA要扩增的DNA片段。模板DNA的质量和浓度会影响PCR反应的效率。引物与模板DNA的特定区域互补配对，引导DNA聚合酶合成新的DNA链。dNTPs四种脱氧核苷酸（dATP、dCTP、dGTP、dTTP），是合成新DNA链的原料。TaqDNA聚合酶耐高温的DNA聚合酶，在PCR循环中负责合成新的DNA链。PCR反应条件的优化退火温度退火温度过低会导致非特异性扩增，而过高则会降低引物与模板的结合效率。循环次数循环次数过少可能导致扩增产物不足，而过多则会导致非特异性扩增。镁离子浓度镁离子浓度过低会降低DNA聚合酶的活性，而过