凝胶色谱柱使用注意事项.pptVIP

中药生物技术S0620336刘利基本内容1结构2性质3应用原理使用方法1一般使用过程2溶剂选择3再生方法4污染处理方法注意问题基本内容SephadexLH-20结构特点SephadexLH-20是SephadexG-25经羟丙基化处理后得到的产物。葡聚糖凝胶中的葡萄糖部分与羟丙基结合成醚键形式。亲脂性的羟丙基是同时具备吸附性层析和分子筛功能的独特层析介质。交联葡聚糖凝胶的化学结构2SephadexLH-20性质交联度小，机械强度低，不耐压，溶胀性大具亲脂性和亲水性，水及有机溶剂中都能应用可用于分子筛层析、吸附层析和分配层析应用范围广泛，适合用有机溶剂分离嗜脂性分子载样量高，极少需要再生主要性能参数分离范围（球蛋白）100-4000颗粒大小（微米）20-150应用范围胆固醇，脂肪酸，激素，维他命，天然产物PH稳定性2-13最高流速（厘米／小时）5003应用原理

凝胶层析的分子筛原理l分子大小不同混合物上柱；2洗脱开始，小分子扩散进人凝胶颗粒内，大分子被排阻于颗粒之外；3大小分子分开：4大分子行程较短，已洗脱出层析柱，小分子尚在进行中吸附原理吸附：范德华力或产生氢键反相分配原理分配：极性与非极性溶剂组成的混合剂（反相溶剂）中起到反相分配的效果使用反相溶剂洗脱，极性大的化合物保留弱，先被洗脱下来，极性小的化合物保留强，后出柱。如果使用正相溶剂洗脱，这主要靠凝胶过滤作用来分离。使用方法制备凝胶悬浮液装柱平衡上样洗脱再生污染处理制备凝胶悬浮液添加标题SephadexLH-20在使用之前必须进行溶胀。添加标题在室温下，将凝胶溶胀于层析溶剂中至少三小时。添加标题在溶胀的过程中，要尽量避免过分搅拌，否则会破坏球形胶粒，且要避免使用磁力搅拌器将干胶往水里加，边加边搅，以防凝胶结块，然后放到沸水浴中加热接近100℃，几个小时就可以使其溶胀，还可起到除去颗粒内部气泡和杀菌作用。PARTONE使溶胀胶体积沉淀之后占总体积的75%，上层溶剂占25%，这时，悬浮液从一个容器倒入另一容器时胶粒可移动。LH-20在不同溶剂中的溶胀性能溶剂????????溶胀体积溶剂????????溶胀体积添加标题ml/g干胶????????ml/g干胶添加标题二甲亚砜???4.2-4.4????????乙醇????????3.2-3.6添加标题吡啶????????4.0-4.3???????异丙醇?????3.1-3.5添加标题水???????3.8-4.2????????四氢呋喃?????3.1-3.5添加标题甲醇????????3.7-4.2????????二氯乙烷?????3.5-4.0添加标题丙醇????????3.4-3.8????????甲苯????????添加标题装柱将溶胀后的凝胶根据装柱要求均匀倒入柱内，在保证胶粒不变形的前提下，应在尽可能高的压力下装柱，反压不要超过1.5ba。柱装得不好往往造成洗脱区带加宽，甚至使一些本来可以分开的区带重叠。如装柱时的操作压力太大，会使凝胶床压得太实，从而降低流速。一般是在柱内先装入约1/3高度的水或缓冲液，然后将溶胀好的凝胶在搅拌成稀浆的情况下慢慢倒入柱内，使其自然沉降。如此连续操作，可以得到一个均匀的柱床。第一章平衡新柱装好后，要用洗脱缓冲液平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液在恒压下流过床。上样前，用洗脱液平衡层析柱至少两个柱体积直到基线变得平稳为止。如改变溶剂应该注意凝胶在新溶剂中的溶胀性质，并根据性质确定柱高调节器的位置，如使用相同的溶剂，在以后的层析中柱平衡可以省略。上样。一般要求样品粘度小于0.01Pa·s（帕斯卡.秒），这样才不致于对分离造成明显影响。上样量视被分离物的结构性能的差异而定－差异大，可大；差异小，应小。样品与柱床体积比例悬殊时分离效果好，但过少的样品量会造成设备和器材的浪费，降低工作效率，还会造成样品稀释。洗脱所有的缓冲液都应该离心或经过0.45um的膜过滤以除去杂质。洗脱流速应根据情况而定，最大张性流速