双向电泳原理及实验步骤.ppt

适用于质谱的染色方法考马斯亮兰（Bio-Safe?Coomassie?colloidal250stain）银染（SilverStainPlus?stain）荧光染色（SYPRO?Rubyproteingelstain）考马斯亮蓝染色胶体考马斯亮蓝染色的检测灵敏度为8-10ng，但染色时间较长（24-48小时），染色过程给下游质谱检测带来较多不便。Bio-Safe染料是一种改良的胶体金染色方法。安全无污染，染色非常快（2小时），完全与下游质谱兼容。考马斯亮蓝检测范围30-100ng，灵敏度较低，但染色过程简单，所需试剂少，操作简便，无毒性，染色后背景及对比度好，与下游质谱兼容，线性程度好。银染银染的检测灵敏度很高，可达到200pg，但其线性很差。普通的银染过程中因醛类的特异反应，而与下游质谱不兼容。快速银染法，可与下游质谱兼容，但其检测灵敏度较低，并伴有很深的背景干扰。Bio-Rad有两种银染试剂盒：普通银染试剂盒——质谱不兼容增强型银染试剂盒——质谱兼容荧光染料灵敏度2-10ng，灵敏度与银染相仿，不对核酸染色染色所需时间较短染色的动态线性范围大大优于胶体金染色，扩展了约1000倍。荧光试剂显色对蛋白质无固定作用，不干扰质谱或免疫检测过程SYPRORuby染料两种染料可分别对两种蛋白质样品进行荧光标记，在一块2-D胶上同步运行，可以很方便的找出差异但因其需要对蛋白质进行共价修饰、改变了标记蛋白质的移动性能由于荧光探针猝灭作用会引起快速衰减。蛋白与蛋白之间由于可被荧光团修饰的功能基团数目不同而使得灵敏度变化很大荧光团的加入会降低蛋白质溶解性能。Cy3和Cy5凝胶的图像处理分析典型流程凝胶图像的扫描：图像加工：斑点检测和定量：凝胶配比：数据分析：数据呈递和解释：2-DE数据库的建立：综合的数据管理PDQuestImageDifferentialAnalysisSpotCuttingProteinDigestionMassSpecPMF/MS-MSGlobalDatabaseSearch/ProteinIDPDQuestImageAuto-annotationPDQuestWorkFlowAcquiretheImageTransformtheImageIdentifytheSpotsCompareImagesAnalyzetheDataExciseSpotsAcquireMSDataPublishaReport二、双向电泳实验流程样品制备（Samplepreparation）1固相预制胶条的水化（IPGstriprehydration）2第一向等电聚焦（IEF）3胶条的平衡（IPGstripequilibration）4第二向SDS电泳（SDSelectrophresis）5凝胶的染色及检测（Detection/Staining）6PDQuest软件分析（Softwareanalysis）7质谱鉴定（Proteinidentification）8最高电压10,000V10?–25?C温度控制7,11,17,18,和24cm的聚焦盘，可以各放12根胶条可以储存10个程序，每个程序有10步程序可进行时时编辑可供选配的打印机等电聚焦的操作对好正、负极，盖上盖子。将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图3）。在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。设置等电聚焦程序。在每根胶条上覆盖1ml矿物油。取出IPG预制胶条（7cmpH4-7），室温平衡。去除预制IPG胶条上的保护层（图2）。等电聚焦的操作对好正、负极，盖上盖子。将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图3）。在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。设置等电聚焦程序。在每根胶条上覆盖1ml矿物油。取出IPG预制胶条（7cmpH4-7），室温平衡。去除预制IPG胶条上的保护层（图2）。等电聚焦的操作对好正、负极，盖上盖子。将IPG胶条置于聚焦盘或水化盘中（图3）。在聚焦盘或水化盘中加入样品（图1）。设置等电聚焦程序。在每根胶条上覆盖1ml矿物油。取出IPG预制胶条（7cmpH4-7），室温平衡。去除预制IPG胶条上的保护层（图2）。蛋白质组双向电泳实验操作1994年，澳大利亚Macquarie大学的Wilkins和Williams首先提出了蛋白质组（Proteome）的概念，其定义为在一种细胞内存在的全部蛋白质。蛋白质组研究中主要应用的技术包括：双相电泳(