3.2.2 DNA片段的扩增及电泳鉴定 课件 人教版生物选择性必修3.pptx

第3章基因工程第2节基因工程的基本操作程序DNA片段的扩增及电泳鉴定

DNA片段的扩增及电泳鉴定1.DNA体外扩增的原理PCR利用了DNA热变性原理，通过调节温度来控制DNA双链的解聚与结合。PCR仪实质上就是一台能够自动调控温度的仪器，一次PCR一般要经历30次循环。2.DNA片段电泳鉴定的原理DNA分子具有可解离的基团，在一定的PH下，这些基团可以带上正电荷或负电荷。在电场的作用下，这些带电分子会向着与它所带电荷相反的电极移动，这个过程就是电泳。在凝胶中DNA分子的迁移速率与凝胶的浓度、DNA分子的大小和构象等有关。凝胶中的DNA分子通过染色，可以在波长为300nm的紫外灯下被检测出来。探究.实践

DNA片段的扩增及电泳鉴定（1）仪器（2）材料PCR仪、微量离心管、微量移液器、一次性吸液枪头、电泳装置（包括电泳仪电泳槽等）4种脱氧核苷酸的等量混合液、2种引物、DNA聚合酶、模板DNA、扩增缓冲液、无菌水、电泳缓冲液、凝胶载样缓冲液、琼脂糖和核酸染料等PCR仪微量离心管微量移液器电泳装置3、材料用具探究.实践

DNA片段的扩增及电泳鉴定3、材料用具PCR反应体系的配方10倍浓缩的扩增缓冲液5ul20mmol/l的4种脱氧核苷酸的等量混合液1ul20umol/l的引物I2.5ul20umol/l的引物II2.5ulH2O28-33ul1-5U/ul的TaqDNA聚合酶1-2U模板DNA5-10ul总体积50ul注：模板DNA的用量为1pg-1ug探究.实践

DNA片段的扩增及电泳鉴定4、实验步骤（PCR）用微量移液器按照PCR反应体系配方或PCR试剂盒的说明书，在微量移液管中依次加入各组分。待所有组分都加入后，盖严离心管的盖子。将微量离心管放入离心机里，离心约10s，使反应液集中在离心管的底部。参照下表的参数，设置好PCR仪的循环程序。将装有反应液的微量离心管放入PCR仪中进行反应。移液离心扩增探究.实践提高反应速率预变性的目的：使DNA充分变性，以利于引物更好地和模板结合

DNA片段的扩增及电泳鉴定4、实验步骤（电泳鉴定）根据待分离DNA片段的大小，用电泳缓冲液配制琼脂糖溶液，一般配制质量体积比0.8%-1.2%的琼脂糖溶液。在沸水浴或微波炉内加热至琼脂糖熔化。稍冷却后，加入适量的核酸染料混匀。将温热的琼脂糖溶液迅速倒入模具，并插入合适大小的梳子，以形成加样孔。凝胶溶液完全凝固，小心拔出梳子，取出凝胶放入电泳槽内。将电泳缓冲液加入电泳槽中，电泳缓冲液没过凝胶1mm为宜。配制琼脂糖溶液制备凝胶探究.实践

DNA片段的扩增及电泳鉴定将扩增得到的PCR产物与凝胶载样缓冲液（内含指示剂）混合，再用微量移液器将混合液缓慢注入凝胶的加样孔内。留一个加样孔加入指示分子大小的标准参照物（Marker）。加样电泳、观察接通电源，根据电泳槽阳极至阴极之间的距离来设定电压，一般为1～5V/cm。待指示剂前沿迁移接近凝胶边缘时，停止电泳。取出凝胶置于紫外灯下观察和照相。4、实验步骤（电泳鉴定）探究.实践

DNA片段的扩增及电泳鉴定注意：1.为避免外源DNA等因素的污染，PCR实验中使用的微量离心管、枪头和蒸馏水等在使用前必须进行高压灭菌处理。2.该实验所需材料可以直接从公司购买，缓冲液和酶应分装成小份，并在-20℃储存。使用前，将所需试剂从冰箱拿出，放在冰块上缓慢融化。3.在向微量离心管中添加反应组分时，每吸取一种试剂后，移液器上的枪头都必须更换。4.在进行操作时，一定要戴好一次性手套。5.PCR扩增不能随意加大试剂用量。探究.实践

11探讨点1.未出现扩增条带的主要原因有哪些？探讨点2.出现非特异性扩增条带的主要原因有哪些？探讨点3.你是否成功扩增出DNA片段？判断的依据是什么？探讨点4.你进行电泳鉴定的结果是几条条带？如果不止一条条带，请分析产生这个结果的可能原因。(1)TaqDNA聚合酶失活或浓度过低。(2)引物出现质量问题。(3)Mg2＋浓度过低。(4)变性时的温度低，变性时间短。(1)模板DNA出现污染。(2)引物特异性不强、引物设计不合理、引物过短。(3)Mg2＋浓度过高。(4)复性时的温度过低等。可以在紫外灯下直接观察到DNA条带的分布及粗细程度来评价扩增的结果。如果扩增不成功，可能的原因有：漏加了PCR的反应成分，各反应成分的用量不当，PCR程序设置不当等。如果扩增结果不止一条条带，可能的原因有：引物设计不合理，它们与非目的序列有同源性或容易形成二聚体；退火温度过低；DNA聚合酶的质量不好等。

(1)利用PCR扩增DNA片段时，在第一轮循环的变性之前，通常要用94℃的高温处理反应液5min进行预变性。(