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生物化学实验报告：蛋白质分子量的测定——凝胶层析法--第1页

实验一蛋白质分子量的测定——凝胶层析法

一、实验目的

1.掌握凝胶层析的基本原理。

2.学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量的实验技能。

二、实验原理

凝胶层析法也称分子筛层析法，是利用具有一定孔径大小的多孔凝胶作固定

相的层析技术。当混合物随流动相经过凝胶层析柱时，其中各组分按其分子大小

不同而被分离的技术。该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高。

凝胶是一种不带电的具有三维空间的多孔网状结构、呈珠状颗粒的物质，每

个颗粒的细微结构及筛孔的直径均匀一致，像筛子，小的分子可以进入凝胶网孔，

而大的分子则排阻于颗粒之外。当含有分子大小不一的蛋白质混合物样品加到用

此类凝胶颗粒装填而成的层析柱上时，这些物质即随洗脱液的流动而发生移动。

大分子物质沿凝胶颗粒间隙随洗脱液移动，流程短，移动速率快，先被洗出层析

柱；而小分子物质可通过凝胶网孔进入颗粒内部，然后再扩散出来，故流程长，

移动速度慢，最后被洗出层析柱，从而使样品中不同大小的分子彼此获得分离。

若分子大小介于上述完全排阻或完全渗入凝胶的物质，则居二者之间从柱中流

出。总之，各种不同相对分子质量的蛋白质分子，最终由于它们被排阻和扩散的

程度不同，在凝胶柱中所经过的路程和时间也不同，从而彼此可以分离开来。

将凝胶装在柱后，柱床体积称为“总体积”，以Vt表示。实质上Vt是由V

o，Vi与Vg三部分组成，Vo称为“孔隙体积”或“外水体积”，即存在于柱床

内凝胶颗粒外面空隙之间的水相体积，相应于一般层析法中柱内流动相的体积；

Vi为内体积，即凝胶颗粒内部所含水相的体积。Vg为凝胶本身的体积。洗脱体

积（Ve）与Vo与Vi之间的关系可用下式表示：Ve=Vo+KdVi

式中Ve为洗脱体积，自加入样品时算起，到组分最大浓度（峰）出现时所

流出的体积；Kd为样品组分在二相间的分配系数，也可以说Kd是分子量不同的

溶质在凝胶内部与外部的分配系数。它只与被分离的物质分子的大小和凝胶颗粒

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孔隙的大小分布有关，而与柱的长度粗细无关，也就是说它对每一物质为常数，

与柱的物理条件无关。Kd可通过实验求得，上式可以改写为:Kd=(Ve-Vo)/Vi

上式中Ve为实际测得的洗脱体积；Vo可用不被凝胶滞留的大分子物质的溶

液（最好是有颜色以便于观察，如血红蛋白，印度黑墨水，分子量约200万的蓝

色葡聚糖-2000等）通过实际测量求得；Vi可由g×Wr求得（g为干胶重量，单

位为克；Wr为凝胶的“吸水量”，以毫升每克表示）。因此，对一层析柱胶床

来说，只要通过实际实验得知某一物质的洗脱体积就可算出它的Kd值。

如果假定蛋白质分子近于球形，同时没有显著的水合作用，则不同大小分子

量的蛋白质，在洗脱时峰的位置和该物质相对分子质量有直接的定量的关系。在

一根凝胶柱中，凝胶颗粒间空隙所含水相体积为外水体积Vo，不能进入凝胶孔

径的那些大分子，当洗脱体积为Vo时，出现洗脱峰。

凝胶颗粒内部孔穴的总体积为内水体积Vi，能全部渗入凝胶的那些小分子，

当洗脱体积为Vo+Vi时，出现洗脱峰。Ve与分子量的关系：对同一类型的化合

物，洗脱特性与组分的分子量有关，流过凝胶柱时，按分子量大小顺序流出，分

子量大的走在前面。Ve与分子量的关系可用下式表示：Ve=K1-K2logM,式中M为

相对分子质量，K1和K2为常数,Ve也可用Ve-Vo。

葡聚糖凝胶有不同的型号，用于分离不同相对分子质量大小的