免疫荧光技术课件.pptVIP

双抗体夹心法的基本实验过程洗涤三次终止液该法主要用于检测抗原包被的抗体与酶标抗体属同一种类抗体每检测一种抗原就需制备相应的酶标抗体，较麻烦（二）间接法测抗体步骤：单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。包被已知Ag＋待测标本（测Ab？）——反应一段时间后，洗涤——加酶标抗抗体（酶标羊抗人IgG）——洗涤——加底物——加终止液，观察结果。该法主要用于测抗体酶标记一种抗抗体可以用于多种抗体的检测包被抗体间接法测抗原加标本（抗原）单击此处添加正文。加抗体单击此处添加正文。加酶标抗抗体单击此处添加正文。（三）双位点一步法01020304步骤：包被抗体A＋待测标本添加标题＋酶标抗体B添加标题——洗涤，＋底物——终止液，观察结果添加标题（检测Ag，Ag至少含A、B两个抗原表位）添加标题该法是一次性加入标本和酶标抗体，试验程序简单，提高了检测的特异性用于检测Ag,且Ag是具有至少2种抗原表位的多价抗原反应系统中固相Ab与酶标Ab的量相对于待测Ag是过量的，因此复合物的形成量与待测Ag含量成正比（在方法可检测范围内）（四）竞争法步骤：待测管：已知Ab包被＋待测标本（Ag？）——洗涤，＋酶标Ag——洗涤，＋底物——显色先加先加（五）应用亲和素和生物素的ELISA添加标题亲和素(avidin)：糖蛋白，一分子由四个亚基组成，每一亚基可以与一分子生物素结合添加标题生物素(biotin)：维生素H，可与蛋白质、糖类、酶类等结合，与亲和素特异结合后极稳定01生物素生物素02亲和素生物素03生物素单击此处添加正文。亲和素—生物素在ELISA中使用：三.ELISA结果的判定（一）肉眼判定与阳性、阴性对照颜色比较：PART01结果判定若待检孔显色浅于阴性对照则判定为阴性；若待检孔显色介于阴性对照孔和阳性对照孔之间则判定为弱阳性。若待检孔显色深于或等于阳性对照孔则判定为阳性；02（二）酶标光度仪检测A492值（吸光率）：比色法与阳性、阴性对照测定值比较P/N比值：大于2.0为阳性，小于2.0为阴性P:positive（待测吸光度值）N:negative01ELISA试验的影响因素固相载体常用固相载体材料：聚苯乙烯。其特点为吸附Ag或Ab的能力强，一但吸附后，不能被洗脱。固相载体：酶标板可分软、硬板一次性使用，不可回收酶标板要求：202X吸附性能好、空白值低、透明度高板批间、孔间性能相近抗原、抗体Ag：需纯化Ab：需效价高、亲和力强、纯化2.间接法单击此处添加正文，文字是您思想的提炼，为了演示发布的良好效果，请言简意赅地阐述您的观点。您的内容已经简明扼要，字字珠玑，但信息却千丝万缕、错综复杂，需要用更多的文字来表述；但请您尽可能提炼思想的精髓，否则容易造成观者的阅读压力，适得其反。分两步：荧光素标记抗抗体（如荧光标记的羊抗人IgG）；已知Ag固定＋待测标本（Ab？）——洗涤，＋荧光标记的抗抗体——洗涤，荧光显微镜镜检间接法用得最多优点：制备一种荧光标记二抗（抗抗体）可用于多种Ab检测灵敏度高补体法：荧光素标记抗补体；已知Ag固定＋待测标本（Ab？）＋补体——洗涤，＋荧光标记的抗补体——洗涤，荧光显微镜镜检灵敏度高，制备一种荧光抗补体用于多特点：干扰因素多，补体不稳定，易失活，种检测单击此处添加正文。该法少用4.双标记法用两种荧光素（FITC、罗丹明）分别标记针对同一Ag上不同抗原表位的抗体，对同一标本染色，当Ag有两种相应抗原表位存在时，可同时见到黄绿和橙红两种荧光。免疫荧光显微技术优缺点优点：特异性、敏感性高快速可定位既可测Ag又可测Ab缺点：需要荧光显微镜存在非特异荧光干扰（产生原因：自发、抗体不纯、交叉反应、技术问题）定性测定、判断结果不客观制备的片子难以长期保存（荧光猝灭）时间分辨荧光免疫测定（液相检测）原理：用铕(Eu)等具有较长荧光寿命的稀土金属作荧光标记物来标记Ab或Ag，从而检测待测标本中相应Ag或Ab的新技术。其特点是：利用时间分辨荧光仪延缓检测时间，排除非特异性干扰荧光。灵敏度可达0.2~1ng/ml。思考题：免疫标记技术的原理免疫荧光技术中最常用的荧光素是什么？免疫荧光显微染色的各种方法及优缺点免疫酶技术Immunoenzymetechnique概述：70年代初在免疫荧光技术基础上建立。较IF、RIA(radioimmunoassay